Production of Bio-Based Isoprene by the Mevalonate Pathway Cassette in Ralstonia eutropha
- 作者
- Hyeok-Won Lee, Jung-Ho Park, Hee-Seok Lee, Wonho Choi, Sung-Hwa Seo, Irika Devi Anggraini, Eui-Sung Choi, Hong-Weon Lee
- 单位
- Biotechnology Process Engineering Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB); Bio-Evaluation Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB); Department of Bioprocess Engineering, University of Science and Technology (UST) of Korea
- 杂志
- Journal of Microbiology and Biotechnology（2019）
- DOI
- 10.4014/jmb.1909.09002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在Ralstonia eutropha中实现基于甲羟戊酸途径的异戊二烯生物合成，并评估启动子类型和拷贝数对产量的影响。
研究策略
将来源于Enterococcus faecalis、Streptococcus pneumoniae、E. coli和Populus trichocarpa的MVA途径及异戊二烯合酶基因按R. eutropha密码子偏好性优化，构建含单启动子（Lac或J5）和三启动子（三个Lac或三个J5）的表达盒，通过T-瓶培养和5-L分批发酵评估异戊二烯产量。
核心内容
本研究以Ralstonia eutropha H16为底盘，首次在该菌中实现基于甲羟戊酸（MVA）途径的异戊二烯生物合成。研究者将来源于粪肠球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌和毛果杨的MVA途径酶及异戊二烯合酶基因按宿主密码子偏好性优化，构建了含单启动子（Lac或J5）和三启动子（三个Lac或三个J5）的表达盒，并通过T-瓶培养与5-L分批发酵评估产量。结果显示，J5启动子产量（1.9±0.24 μg/L）高于Lac启动子（1.5±0.2 μg/L），三J5启动子产量（3.8±0.18 μg/L）亦优于三Lac启动子（3.4±0.05 μg/L）。在5-L发酵中，含三J5启动子的菌株RE-MVA8产量达28.45 mg/L，含三Lac启动子的RE-MVA7产量为22.9 mg/L。密码子优化使RE-MVA5的产量达到未优化菌株的3.33倍，最大比产量为2.53 μg异戊二烯/OD，碳产量为1.9 μg/g碳源。该研究证实R. eutropha可作为异戊二烯生产的潜在底盘，但当前产量仍低于工业要求，后续需通过增强异源酶表达、优化碳通量及补充ATP供给，并结合补料分批发酵等策略进一步提升产量。
创新点
首次在Ralstonia eutropha中实现异戊二烯生产；采用密码子优化和多启动子系统（尤其三J5启动子）有效提高异戊二烯产量。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ralstonia eutropha H16 | 甲羟戊酸途径 | mvaS | 羟甲基戊二酰辅酶A合酶 | 催化 | 来源于Enterococcus faecalis，催化乙酰-CoA生成HMG-CoA |
| Ralstonia eutropha H16 | 甲羟戊酸途径 | mvaE | 羟甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 来源于Enterococcus faecalis，催化HMG-CoA生成甲羟戊酸 |
| Ralstonia eutropha H16 | 甲羟戊酸途径 | mvaK1 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来源于Streptococcus pneumoniae |
| Ralstonia eutropha H16 | 甲羟戊酸途径 | mvaK2 | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来源于Streptococcus pneumoniae |
| Ralstonia eutropha H16 | 甲羟戊酸途径 | mvaD | 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 | 催化 | 来源于Streptococcus pneumoniae |
| Ralstonia eutropha H16 | 甲羟戊酸途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 来源于E. coli，催化IPP和DMAPP互变 |
| Ralstonia eutropha H16 | 异戊二烯合成 | ispS | 异戊二烯合酶 | 催化 | 来源于Populus trichocarpa，催化DMAPP生成异戊二烯 |
| Ralstonia eutropha H16 | 基因表达调控 | — | — | 调控 | 使用Lac启动子（PLac）和J5启动子（PJ5），其中J5启动子强度高于Lac启动子 |
| Ralstonia eutropha H16 | 基因表达调控 | — | — | 调控 | 三启动子系统（PLLL和PJJ）用于增强MVA途径基因表达，PJJ效果最佳 |
关键发现
- J5启动子产量（1.9±0.24 μg/l）高于lac启动子（1.5±0.2 μg/l）
- 三J5启动子产量（3.8±0.18 μg/l）高于三lac启动子（3.4±0.05 μg/l）
- 5-L分批发酵中，含三J5启动子的RE-MVA8产量达28.45 mg/l，含三Lac启动子的RE-MVA7产量为22.9 mg/l
- 密码子优化后RE-MVA5的产量是未优化菌株TS-sPt-MVA1的3.33倍
- 最大比产量为2.53 μg isoprene/OD，碳产量为1.9 μg isoprene/g碳源。
研究结论
Ralstonia eutropha可作为异戊二烯生物合成的潜在底盘，但当前产量仍不足以满足工业需求，未来可通过增强异源酶表达、优化碳通量及补充ATP供给并结合分批补料等发酵策略进一步提高产量。