Overexpression of allene oxide cyclase promoted tanshinone/ phenolic acid production in Salvia miltiorrhiza
- 作者
- Xiao-Ce Gu, Jun-Feng Chen, Ying Xiao, Peng Di, Hong-Jiao Xuan, Xun Zhou, Lei Zhang, Wan-Sheng Chen
- 单位
- Department of Pharmacy, Changzheng Hospital, Second Military Medical University; Department of Pharmacognosy, School of Pharmacy, Second Military Medical University; Department of Plant Sciences, University of California, Davis
- 杂志
- Plant Cell Reports（2012）
- DOI
- 10.1007/s00299-012-1334-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过基因工程手段持久高效地提高丹参中丹参酮IIA、迷迭香酸和紫草酸B等活性次生代谢产物的含量，以替代外源茉莉酸甲酯诱导的短期效果。
研究策略
克隆丹参中的丙二烯氧化物环化酶基因SmAOC，并利用发根农杆菌介导的转基因技术在丹参毛状根中过表达SmAOC，通过增强内源茉莉酸生物合成来全局激活次生代谢通路。
核心内容
该研究从丹参中克隆了丙二烯氧化物环化酶基因SmAOC，其cDNA全长910 bp，编码245个氨基酸，通过发根农杆菌介导的转基因技术在丹参毛状根中过表达该基因。SmAOC表达受茉莉酸甲酯、低温和紫外等胁迫诱导，其中低温处理12至24小时使表达量提升近10倍。过表达SmAOC的转基因毛状根中内源茉莉酸合成增强，并全局性激活了丹参酮和酚酸生物合成通路中PAL、4CL、HPPR、DXR、HMGR、CMK等多个关键酶基因的表达。最佳转基因系中丹参酮IIA含量达到0.56 mg/g DW，为野生型的15.1倍；迷迭香酸和紫草酸B含量分别达到2.8 mg/g DW和19.0 mg/g DW，分别比野生型提高约2.1倍和1.8倍。该结果表明工程化茉莉酸生物合成途径中AOC这一限速酶，可作为一种全局性代谢调控策略，持久高效地替代外源茉莉酸甲酯诱导，提高丹参中多种活性次生代谢产物的积累水平。
创新点
首次从丹参中克隆并功能鉴定SmAOC基因；证明过表达SmAOC可通过调控内源茉莉酸合成显著提高丹参毛状根中丹参酮IIA、迷迭香酸和紫草酸B的产量；提出与单基因或少数几个通路基因改造相比，工程化茉莉酸生物合成是一种更高效的全局性代谢调控策略。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Salvia miltiorrhiza | 茉莉酸生物合成途径（十八碳烷酸途径） | SmAOC | 丙二烯氧化物环化酶（AOC, EC 5.3.99.6） | 催化 | 催化丙二烯氧化物环化为9S,13S-OPDA，决定天然茉莉酸立体构型，是JA生物合成的关键步骤 |
| Salvia miltiorrhiza | 丹参酮生物合成（二萜途径，MEP途径） | SmDXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | MEP途径关键酶，受SmAOC过表达诱导，表达水平与丹参酮IIA积累相关 |
| Salvia miltiorrhiza | 丹参酮生物合成（二萜途径，MVA途径） | SmHMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 甲羟戊酸途径限速酶，在SmAOC高表达转基因系中表达上调 |
| Salvia miltiorrhiza | 丹参酮生物合成（二萜途径，MEP途径） | SmCMK | 胞苷一磷酸激酶 | 催化 | MEP途径酶，在SmAOC转基因系中表达增强 |
| Salvia miltiorrhiza | 迷迭香酸/酚酸生物合成途径 | SmPAL | 苯丙氨酸解氨酶 | 催化 | 酚酸途径起始酶，在所有SmAOC转基因系中均显著上调，可能对RA合成起重要调控作用 |
| Salvia miltiorrhiza | 迷迭香酸/酚酸生物合成途径 | Sm4CL | 4-香豆酸辅酶A连接酶 | 催化 | 在T1和T7中表达较高，与紫草酸B积累趋势一致 |
| Salvia miltiorrhiza | 迷迭香酸/酚酸生物合成途径 | SmHPPR | 4-羟基苯丙酮酸还原酶 | 催化 | 在T1和T7中表达较高，可能与LAB生物合成相关 |
| Salvia miltiorrhiza | 茉莉酸信号通路 | SmAOC | 丙二烯氧化物环化酶 | 调控 | 通过提高内源茉莉酸水平，全局调控茉莉酸响应基因及次生代谢通路基因表达 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达体系 | SmAOC | 丙二烯氧化物环化酶 | 催化 | 异源表达重组蛋白约为45 kDa（含18 kDa标签），并增强盐耐受性，表明AOC可能有JA生物合成外的功能 |
关键发现
- 克隆的SmAOC cDNA全长910 bp，ORF 738 bp，编码245个氨基酸，预测分子量26.795 kDa，含123 bp内含子。在E. coli中表达重组SmAOC蛋白约45 kDa（含18 kDa标签），验证SmAOC可增强E. coli盐耐受性。MeJA处理2 h时SmAOC表达达峰值（为原始值的6倍），UV处理24 h后表达降至0 h的四分之一，低温4°C处理12-24 h表达增加近10倍。过表达SmAOC的丹参毛状根中，最佳克隆T7的丹参酮IIA含量达0.56 mg/g DW，是野生型（0.037 mg/g DW）的15.1倍
- T1的迷迭香酸含量2.8 mg/g DW，为野生型（1.3 mg/g DW）的2.1倍
- T1的紫草酸B含量19.0 mg/g DW，为野生型（10.7 mg/g DW）的1.8倍和空载体对照（8.1 mg/g DW）的2.3倍。转基因根中SmAOC表达最高达野生型的12倍。PAL、4CL、HPPR、DXR、HMGR、CMK等通路基因表达在转基因系中均有不同程度升高。
研究结论
丹参SmAOC过表达能够通过增强内源茉莉酸合成，显著提高丹参毛状根中丹参酮IIA、迷迭香酸和紫草酸B的积累，并激活相关代谢通路基因表达。AOC是茉莉酸途径中关键限速酶，是提高植物有用次生代谢产物含量的优良候选基因资源。