Production of the dammarene sapogenin (protopanaxadiol) in transgenic tobacco plants and cultured cells by heterologous expression of PgDDS and CYP716A47
- 作者
- Ju-Hyeon Chun, Prakash Babu Adhikari, Seong-Bum Park, Jung-Yeon Han, Yong-Eui Choi
- 单位
- Department of Forest Resources, College of Forest and Environmental Sciences, Kangwon National University, Chunchon 200-701, Republic of Korea
- 杂志
- Plant Cell Reports（2015）
- DOI
- 10.1007/s00299-015-1806-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
原人参二醇（PPD）是达玛烷型人参皂苷的苷元，具有重要药理活性，但在人参植物中含量极低且难以化学合成，需要建立异源生产系统。
研究策略
通过农杆菌介导的转化，在烟草中共表达人参PgDDS和CYP716A47基因，并建立愈伤组织和细胞悬浮培养体系，利用2,4-D处理增强代谢通量，在摇瓶和生物反应器中生产PPD。
核心内容
本研究通过农杆菌介导法将人参来源的PgDDS和CYP716A47基因共转化至烟草，建立表达达玛烯二醇合成酶和细胞色素P450氧化酶的转基因植株及愈伤组织悬浮培养体系，用于异源生产原人参二醇（PPD）。结果显示，转基因烟草叶片中PPD含量为2.3–5.7 μg/g DW，根中DD和PPD分别为14.6和16.8 μg/g DW。2,4-D处理可显著增强代谢通量，愈伤组织中DD和PPD最高达783.8 μg/g DW和125.9 μg/g DW，较根部提升53.7倍和7.5倍，同时抑制植物甾醇积累。进一步在5L气球型生物反应器中进行悬浮培养，细胞鲜重增加13.5倍，PPD产量达到980.9 μg/g DW，为摇瓶培养的1.4倍。2,4-D处理还上调了HMGR和角鲨烯环氧酶基因的转录，表明其通过强化MVA途径前体供给促进三萜积累。该研究首次证实烟草细胞培养体系可高效生产达玛烷型皂苷元，为PPD的规模化生物制造提供了可行方案。
创新点
首次在转基因烟草中通过共表达PgDDS和CYP716A47成功生产PPD；发现2,4-D能显著促进DD和PPD积累并抑制植物甾醇合成，可能通过上调HMGR和角鲨烯环氧酶基因表达实现；建立了5L气球型生物反应器悬浮培养体系，PPD产量达到980.9 μg/g DW。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 达玛烷型三萜皂苷生物合成途径 | PgDDS | Dammarenediol-II synthase (PgDDS) | 催化 | 异源表达，催化2,3-氧化鲨烯生成达玛烯二醇-II |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 达玛烷型三萜皂苷生物合成途径 | CYP716A47 | Cytochrome P450 716A47 (CYP716A47) | 催化 | 异源表达，催化达玛烯二醇-II C-12羟基化生成原人参二醇 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 甲羟戊酸（MVA）途径 | HMGR1 | 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR1) | 催化 | 内源基因，受2,4-D处理转录增强 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | MVA途径下游的甾醇/三萜合成 | Squalene synthase | Squalene synthase | 催化 | 内源基因，2,4-D处理对其转录无明显影响 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | MVA途径下游的甾醇/三萜合成 | Squalene epoxidase | Squalene epoxidase | 催化 | 内源基因，受2,4-D处理转录增强 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 植物甾醇生物合成途径 | Cycloartenol synthase | Cycloartenol synthase | 催化 | 内源基因，受2,4-D处理转录增强 |
关键发现
- 转基因烟草叶片中PPD含量为2.3-5.7 μg/g DW，其中Tr6系最高为5.6 μg/g DW
- 根中DD和PPD含量分别为14.6和16.8 μg/g DW。2,4-D处理的愈伤组织中DD和PPD分别达783.8 μg/g DW和125.9 μg/g DW，较根部分别提高53.7倍和7.5倍
- 同时植物甾醇（菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇）积累降低。摇瓶培养中细胞鲜重增加12.9倍，DD和PPD产量分别为32.6 μg/g DW和689.9 μg/g DW
- 5L生物反应器中鲜重增加13.5倍，DD和PPD产量分别为166.9 μg/g DW和980.9 μg/g DW。2,4-D处理增强了HMGR和角鲨烯环氧酶基因的转录。
研究结论
研究表明，通过转基因烟草细胞悬浮培养共表达PgDDS和CYP716A47可以高效生产PPD，其中生物反应器培养产量最高，为大规模生产达玛烷型皂苷元提供了可行方案。