Functional characterization of a chalcone synthase from the liverwort Plagiochasma appendiculatum
- 作者
- Hai-Na Yu, Lei Wang, Bin Sun, Shuai Gao, Ai-Xia Cheng, Hong-Xiang Lou
- 单位
- Key Laboratory of Chemical Biology of Natural Products, Ministry of Education; School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China
- 杂志
- Plant Cell Reports（2014）
- DOI
- 10.1007/s00299-014-1702-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
苔藓植物中查尔酮合酶的功能尚未被详细表征，该研究旨在从地钱纲植物 Plagiochasma appendiculatum 中克隆并鉴定查尔酮合酶 PaCHS，探究其生化特性及在黄酮生物合成中的作用。
研究策略
从 P. appendiculatum 克隆 PaCHS 基因并异源表达于大肠杆菌，进行序列比对、同源建模、体外酶活测定和动力学分析；通过农杆菌介导转化 M. paleacea 愈伤组织，检测总黄酮含量；并用 MeJA、ABA、SA 处理分析表达模式。
核心内容
该研究从苔类植物紫背苔中克隆了查尔酮合酶基因PaCHS，其开放阅读框长1236 bp，编码411个氨基酸，与其它植物CHS的一致性为60–70%。将PaCHS异源表达于大肠杆菌后，重组蛋白能以p-香豆酰-CoA和丙二酰-CoA为底物体外生成柚皮素，最适温度为35°C、最适pH为7.4，对p-香豆酰-CoA的Km为11.7 μM。通过农杆菌介导转化构建了地钱愈伤组织异源表达体系，表达PaCHS的愈伤组织总黄酮含量显著升高。MeJA和ABA处理24小时可使PaCHS转录水平升至对照的约4倍，表明该基因参与非生物胁迫响应。此外，MpSTCS2同样具有催化活性，而PaSTCS1则无柚皮素生成活性。该工作首次在苔类植物中功能表征了查尔酮合酶，证实其催化机制与底物选择性与高等植物高度保守，为理解苔藓植物黄酮代谢途径的演化提供了直接证据，也为利用苔藓体系进行黄酮类化合物的异源生产奠定了基础。
创新点
['首次在苔类植物中功能表征查尔酮合酶', '揭示 PaCHS 内含子位置与其他 CHS 基因不同', '建立了基于 M. paleacea 愈伤组织的农杆菌介导转化体系']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 黄酮生物合成 | PaCHS | PaCHS | 催化 | 重组蛋白用于体外酶活检测，催化 p-香豆酰-CoA 与丙二酰-CoA 生成 naringenin |
| Marchantia paleacea 愈伤组织 | 黄酮生物合成 | PaCHS | PaCHS | 催化 | 通过农杆菌介导异源表达，提高总黄酮含量 |
| Plagiochasma appendiculatum | 黄酮生物合成 | PaCHS | PaCHS | 催化 | 基因表达受MeJA、ABA和SA诱导 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 黄酮生物合成 | MpSTCS2 | MpSTCS2 | 催化 | 来自地钱 Marchantia polymorpha 的同源蛋白，也能催化生成 naringenin chalcone |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 黄酮生物合成 | PaSTCS1 | PaSTCS1 | 催化 | 来自 P. appendiculatum 的另一个 CHS-like 基因，但未检测到 naringenin 生成活性 |
关键发现
- 从 P. appendiculatum 克隆的 PaCHS 基因 ORF 长 1236 bp，编码 411 个氨基酸残基，与其它植物的查尔酮合酶一致性为 60-70%。重组 PaCHS 能以 p-香豆酰-CoA 和丙二酰-CoA 为底物体外生成 naringenin，产物 m/z 为 271。酶学性质显示最适温度 35°C、最适 pH
- 4；对 p-香豆酰-CoA 的 Km 为
- 7±3.8 μM，kcat 为
- 0129 s^-1；对丙二酰-CoA 的 Km 为
- 76±3.3 μM，kcat 为
- 0129 s^-1。MeJA、ABA 处理 24 h 时 PaCHS 转录水平约为对照的 4 倍，SA 处理 12-24 h 时约 4 倍。异源表达 PaCHS 的 M. paleacea 愈伤组织总黄酮含量显著提高。此外，MpSTCS2 也有催化活性，而 PaSTCS1 无 naringenin 生成活性。
研究结论
PaCHS 是苔类植物黄酮生物合成的一个关键酶，其结构与功能与高等植物 CHS 高度保守；PaCHS 对非生物胁迫有响应；异源表达可提高黄酮积累。该研究为苔藓植物黄酮代谢及其演化提供了新证据。