Establishment of transgenic Rhazya stricta hairy roots to modulate terpenoid indole alkaloid production
- 作者
- Amir Akhgari, Teijo Yrjönen, Into Laakso, Heikki Vuorela, Kirsi-Marja Oksman-Caldentey, Heiko Rischer
- 单位
- VTT Technical Research Centre of Finland Ltd; Division of Pharmaceutical Biosciences, Faculty of Pharmacy, University of Helsinki
- 杂志
- Plant Cell Reports（2016）
- DOI
- 10.1007/s00299-015-1841-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
建立Rhazya stricta转基因毛状根培养系统，以研究并调控萜类吲哚生物碱（TIA）的产量，填补该植物代谢工程研究的空白。
研究策略
利用野生型及携带GUS报告基因的农杆菌根癌菌（A. rhizogenes LBA 9402）感染不同外植体诱导毛状根，通过PCR和GUS染色验证转化，采用HPLC和UPLC-MS分析生物碱组成，并考察光照和培养基对生物碱积累的影响。
核心内容
本研究首次建立了艾氏长春花（Rhazya stricta）的转基因毛状根培养体系，旨在填补该植物萜类吲哚生物碱（TIA）代谢工程研究的空白。研究者利用农杆菌LBA 9402感染不同外植体诱导毛状根，分别获得携带rolB基因的野生型克隆和携带GUS报告基因的转基因克隆，转化效率分别为74%和83%。通过HPLC和UPLC-MS分析发现，野生型毛状根中五种生物碱含量显著高于非转化根，其中蛇根碱为该植物中首次报道的新化合物。值得注意的是，黑暗条件下长春蔓胺含量较16小时光周期处理高6倍，表明光照条件显著影响TIA积累；改良Gamborg B5培养基中部分化合物含量也优于Woody Plant Medium。该体系不仅证明了农杆菌介导转化在R. stricta中的高效性，还揭示了黑暗培养和培养基优化对提升目标生物碱产量的潜力，为后续通过代谢工程手段调控该植物TIA生物合成提供了可操作的研究平台。
创新点
首次建立R. stricta转基因毛状根体系；鉴定出蛇根碱（serpentine）作为该植物中未见报道的新化合物；系统比较了野生型与转基因克隆、光照及培养基条件对TIA积累的影响。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhazya stricta（艾氏长春花） | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | rolB | RolB蛋白 | 调控 | 来自农杆菌Ri质粒，促进毛状根形成与生长 |
| Rhazya stricta（艾氏长春花） | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | gusA | β-葡萄糖醛酸酶（GUS） | 催化 | 报告基因，用于验证转化事件 |
| Rhazya stricta（艾氏长春花） | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | hph | 潮霉素磷酸转移酶 | 催化 | 赋予潮霉素抗性，用于筛选转基因克隆 |
关键发现
- 种子发芽率达73.3%
- 野生型和GUS克隆的转化效率分别为74%和83%
- 野生型毛状根中长春蔓胺、利帕辛异构体II、斯垂体苷内酰胺、蛇根碱和化合物6共五种生物碱含量显著高于非转化根，GUS克隆中长春蔓胺和斯垂体苷内酰胺含量显著高于非转化根
- 黑暗条件下长春蔓胺含量较16h光周期高6倍
- 改良Gamborg B5培养基中化合物4和6含量显著高于Woody Plant Medium
- 两种培养基中毛状根鲜重均约3.1g、干重约1.0g
- HPLC方法日内精密度为2.1-2.8%，日间精密度为3.4-4.7%。
研究结论
成功建立了农杆菌介导的R. stricta毛状根转化体系，潮霉素筛选高效；毛状根中大部分TIA显著积累，多数生物碱在黑暗条件下产量更高；该体系为R. stricta的代谢工程改造和TIA产量提升提供了有效工具。