CYP716A179 functions as a triterpene C-28 oxidase in tissue-cultured stolons of Glycyrrhiza uralensis
- 作者
- Keita Tamura, Hikaru Seki, Hideyuki Suzuki, Mareshige Kojoma, Kazuki Saito, Toshiya Muranaka
- 单位
- Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka University; Department of Research and Development, Kazusa DNA Research Institute; Faculty of Pharmaceutical Sciences, Health Sciences University of Hokkaido; Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Chiba University
- 杂志
- Plant Cell Reports（2017）
- DOI
- 10.1007/s00299-016-2092-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
甘草（Glycyrrhiza uralensis）中缺乏CYP716A亚家族P450的鉴定，限制了对其三萜代谢途径的理解和甘草酸生物合成的工程改造。
研究策略
利用组织培养葡萄茎的RNA-seq分析，挖掘与CYP716A12同源的P450基因，并通过在工程酵母中异源表达验证其催化功能，结合转录水平和代谢物积累分析阐明其组织特异性作用。
核心内容
甘草（Glycyrrhiza uralensis）中CYP716A亚家族P450的鉴定此前一直空白，限制了对其三萜代谢途径的理解与甘草酸生物合成的工程改造。该研究通过组织培养葡萄茎的RNA-seq分析，挖掘到与苜蓿CYP716A12高度同源的P450基因，命名为CYP716A179（氨基酸一致性86%），并在工程酵母中异源表达验证其功能。结果显示，CYP716A179作为三萜C-28氧化酶，可催化β-香树脂醇、α-香树脂醇和羽扇豆醇分别生成齐墩果酸、熊果酸和桦木酸。转录与代谢物分析表明，CYP716A179在组织培养葡萄茎中的转录水平比完整根高约500倍，齐墩果酸和桦木酸仅在组织培养葡萄茎中检测到（分别为18.08和30.95 μg/g干重），而完整根中甘草次酸含量高达27260 μg/g干重，远高于组织培养葡萄茎。此外，CYP88D6转录水平在完整根中比组织培养葡萄茎高约700倍。这些结果说明CYP716A179是甘草中参与齐墩果酸和桦木酸生物合成的关键氧化酶，其表达与组织培养体系中这两种化合物的积累高度相关，可作为通过抑制竞争途径提高甘草组织培养中甘草酸产量的潜在靶基因。
创新点
首次从甘草中分离并鉴定了CYP716A亚家族P450（CYP716A179），证明其具有三萜C-28氧化酶功能，能催化β-香树脂醇、α-香树脂醇和羽扇豆醇分别生成齐墩果酸、熊果酸和桦木酸。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母INVSc1 | 三萜生物合成 | CYP716A179 | CYP716A179 | 催化 | 催化β-香树脂醇、α-香树脂醇和羽扇豆醇的C-28位三步氧化反应，分别生成齐墩果酸、熊果酸和桦木酸 |
| 酿酒酵母INVSc1 | 三萜生物合成 | bAS (OSC1) | β-香树脂醇合酶 | 催化 | 在酵母中产生β-香树脂醇，作为CYP716A179的底物 |
| 酿酒酵母INVSc1 | 三萜生物合成 | aAS | α-香树脂醇合酶 | 催化 | 在酵母中产生α-香树脂醇（并副产β-香树脂醇），作为CYP716A179的底物 |
| 酿酒酵母INVSc1 | 三萜生物合成 | LUS | 羽扇豆醇合酶 | 催化 | 在酵母中产生羽扇豆醇，作为CYP716A179的底物 |
| 酿酒酵母INVSc1 | 三萜生物合成 | CPR1 (Lotus japonicus) | 细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 为CYP716A179提供电子，参与氧化反应 |
| 甘草（Glycyrrhiza uralensis） | 甘草酸生物合成 | CYP88D6 | CYP88D6 | 催化 | β-香树脂醇11-氧化酶，甘草酸生物合成关键酶，在完整根中高表达 |
| 甘草（Glycyrrhiza uralensis） | 甘草酸生物合成 | CYP72A154 | CYP72A154 | 催化 | 11-氧代-β-香树脂醇30-氧化酶，甘草酸生物合成关键酶，在完整根中高表达 |
| 甘草（Glycyrrhiza uralensis） | 大豆皂苷生物合成 | CYP93E3 | CYP93E3 | 催化 | β-香树脂醇24-羟化酶，大豆皂苷生物合成初始关键酶 |
关键发现
- CYP716A179与苜蓿CYP716A12氨基酸一致性为86%；在组织培养葡萄茎中CYP716A179转录水平比完整根高约500倍；完整根中甘草次酸含量比组织培养葡萄茎高约1000倍（27260±1120 vs
- 19±10.73 μg/g干重）；齐墩果酸和桦木酸仅在组织培养葡萄茎中检测到（分别为18.08±4.56和30.95±0.45 μg/g干重）；大豆皂醇B在组织培养葡萄茎中含量是完整根的20倍以上（207.4±4.5 vs
- 77±0.99 μg/g干重）；LUS转录水平在组织培养葡萄茎中比完整根高约90倍；CYP88D6转录水平在完整根中比组织培养葡萄茎高约700倍。
研究结论
CYP716A179是甘草中参与齐墩果酸和桦木酸生物合成的三萜C-28氧化酶，其表达与组织培养葡萄茎中这两种化合物的积累高度相关，可作为通过破坏竞争途径提高甘草组织培养中甘草酸产量的潜在靶基因。