Disruption of a licorice cellulose synthase-derived glycosyltransferase gene demonstrates its in planta role in soyasaponin biosynthesis
- 作者
- Manami Sakanishi, Soo Yeon Chung, Kentaro Fujiwara, Mareshige Kojoma, Toshiya Muranaka, Hikaru Seki
- 单位
- Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka University; Faculty of Pharmaceutical Sciences, Health Sciences University of Hokkaido; Industrial Biotechnology Initiative Division, Institute for Open and Transdisciplinary Research Initiatives, Osaka University
- 杂志
- Plant Cell Reports（2023）
- DOI
- 10.1007/s00299-023-03095-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
甘草中纤维素合酶来源的糖基转移酶GuCSyGT在植物体内对大豆皂苷生物合成的作用此前尚不清楚，需要确证其在体内的功能。
研究策略
利用CRISPR-Cas9介导的多重基因组编辑在甘草毛状根中敲除GuCSyGT基因，通过LC-MS和GC-MS分析皂苷及其代谢中间体的含量变化。
研究路线图
核心内容
该研究通过CRISPR-Cas9多重基因组编辑技术，在甘草毛状根中敲除纤维素合酶来源的糖基转移酶基因GuCSyGT，以确证其在大豆皂苷生物合成中的体内功能。研究者从158个毛状根系中筛选出47个潜在编辑株系，最终确认两个纯合敲除株系GE-1和GE-2，其中GE-1携带403 bp缺失/23 bp插入导致的移码突变，GE-2两个等位基因分别发生364 bp缺失/21 bp插入和49 bp缺失移码。LC-MS分析显示，GE株系中大豆皂苷I、大豆皂苷III和大豆皂苷元B单葡萄糖醛酸苷完全消失；GC-MS检测进一步表明大豆皂苷元B彻底缺失，而24-羟基-β-香树脂醇大量积累至对照中无法检出的水平，皂皮二醇亦完全消失。qPCR证实GuCSyGT转录水平显著降低，而CYP72A566和CYP93E3表达未受影响。该结果首次在植物体内证实GuCSyGT催化三萜皂苷元C3位葡萄糖醛酸化，是大豆皂苷合成必需的酶；其缺失意外阻断了CYP72A566催化的后续氧化步骤，提示该途径可能存在底物通道或反馈调控机制。同时，本研究展示了基因组编辑在难转化非模式植物毛状根基因功能解析中的应用潜力。
创新点
首次在植物体内证实GuCSyGT是大豆皂苷生物合成所必需的酶；发现GuCSyGT缺失导致大豆皂苷元B合成受阻，提示存在未知的调控机制；展示了CRISPR-Cas9基因组编辑在难转化非模式植物毛状根研究中的应用价值。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Glycyrrhiza uralensis（甘草）毛状根 | 三萜皂苷生物合成途径（大豆皂苷合成） | GuCSyGT | GuCSyGT（纤维素合酶来源的糖基转移酶） | 催化 | 催化三萜皂苷元C3位葡萄糖醛酸化，敲除后大豆皂苷I、III及SBMG完全缺失 |
| Glycyrrhiza uralensis（甘草）毛状根 | 三萜皂苷生物合成途径（大豆皂苷元B合成） | CYP72A566 | CYP72A566（细胞色素P450单加氧酶） | 催化 | 催化β-香树脂醇和24-羟基-β-香树脂醇的C22位羟基化，其产物在GuCSyGT敲除株系中缺失 |
| Glycyrrhiza uralensis（甘草）毛状根 | 三萜皂苷生物合成途径 | CYP93E3 | CYP93E3（细胞色素P450单加氧酶） | 催化 | qPCR分析显示其转录水平在敲除株系中无显著变化，可能参与大豆皂苷生物合成 |
关键发现
- GuCSyGT基因结构包含9个外显子
- 从158个毛状根系中筛选出47个潜在编辑株系，最终确认2个纯合敲除株系GE-1和GE-2
- GE-1中检测到403 bp缺失/23 bp插入导致移码，GE-2中一个等位基因发生364 bp缺失/21 bp插入（导致66 aa缺失和8 aa插入），另一个等位基因发生49 bp缺失移码
- GE株系中大豆皂苷I、大豆皂苷III和大豆皂苷元B单葡萄糖醛酸苷完全缺失
- 酸水解产物GC-MS分析显示GE株系中大豆皂苷元B完全消失，而24-羟基-β-香树脂醇大量积累（对照中未检出），皂皮二醇在对照中检出而GE株系缺失
- qPCR表明GuCSyGT转录水平显著降低，而CYP72A566和CYP93E3转录水平无显著差异
- GE株系中桦木酸含量略有增加。
研究结论
GuCSyGT在甘草体内催化三萜皂苷元C3位的葡萄糖醛酸化反应，是大豆皂苷生物合成所必需的酶；其缺失导致大豆皂苷无法合成，并意外阻断了CYP72A566催化的后续氧化步骤，表明大豆皂苷生物合成可能存在底物通道或反馈调控；同时本研究证明基因组编辑可用于非模式植物毛状根的基因功能分析和代谢工程。