高级醇 · 代谢工程文献库

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Activation of the native PHYTOENE SYNTHASE 1 promoter by modifying near-miss cis-acting elements induces carotenoid biosynthesis in embryogenic rice callus

作者
Guillermo Sobrino-Mengual, Derry Alvarez, Richard M. Twyman, Christopher Gerrish, Paul D. Fraser, Teresa Capell, Paul Christou
单位
Applied Plant Biotechnology Group, Department of Agricultural and Forest Sciences and Engineering, University of Lleida-Agrotecnio CERCA Center, Lleida, Spain; TRM Ltd, Scarborough, UK; ICREA, Catalan Institute for Research and Advanced Studies, Barcelona, Spain; Department of Biological Sciences, Royal Holloway University of London, Egham, UK; Division of Biological and Environmental Sciences and Engineering, Center for Desert Agriculture, BioActives Lab, King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), Thuwal, Saudi Arabia
杂志
Plant Cell Reports（2024）
DOI
10.1007/s00299-024-03199-7
所属领域
代谢工程
关键词
CallusCarotenoidsEndospermMetabolic engineeringPromotercis-acting element
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解决的核心问题

水稻胚乳中类胡萝卜素生物合成因PSY1基因沉默而受阻，如何通过启动子修饰激活内源沉默基因以实现胚乳中的代谢工程

研究策略

SLEEPER策略：筛选PSY1启动子中与胚乳特异顺式元件接近但失活的序列（近失配元件），通过定点突变将其修正为功能性元件（4M和6M启动子），并融合GFP或PSY1基因转化水稻愈伤验证；同时共转化PDS基因以评估类胡萝卜素积累

研究路线图

100%
问题：PSY1沉默致水稻胚乳类胡萝卜素缺乏
策略：SLEEPER启动子原位修饰激活
筛选PSY1启动子近失配顺式元件
定点突变：构建4M和6M启动子
转化验证：GFP标记与PSY1表达
结果：6M启动子激活PSY1表达2倍
结果：共转化PDS，β-胡萝卜素39.17 μg/gDW
结论：SLEEPER策略激活类胡萝卜素合成，为代谢工程提供新工具
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核心内容

该研究提出SLEEPER策略，通过原位修饰水稻内源PSY1启动子中的近失配顺式作用元件，激活沉默的类胡萝卜素合成通路。作者筛选出PSY1启动子中与胚乳特异元件序列接近但功能丧失的位点，经定点突变修正为功能性元件，构建4M和6M启动子，融合GFP或PSY1基因转化水稻愈伤组织。结果显示，4M启动子使GFP相对mRNA水平从0.1–0.2提高至0.8–1，并在愈伤和T1种子中检测到蛋白；6M启动子使PSY1 mRNA水平较天然启动子平均升高约2倍。共转化PDS基因后，6M-PSY1愈伤呈深橙色，八氢番茄红素最高达7.13 μg/g DW，β-胡萝卜素最高达39.17 μg/g DW。相比之下，天然启动子或仅4M启动子驱动的PSY1未积累类胡萝卜素。该工作首次证明仅修正1–4个碱基的近失配元件即可将沉默的内源启动子转化为功能性表达启动子，为植物营养强化提供了不依赖外源强启动子的代谢工程新工具。

创新点

首次将启动子原位修饰用于异位激活沉默的内源基因（SLEEPER），而非仅调节已表达基因；仅通过修正启动子中1-4个碱基的近失配元件即可激活PSY1并诱导类胡萝卜素积累

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
水稻胚性愈伤组织（Oryza sativa cv. Bomba） 类胡萝卜素生物合成 PSY1 PSY1（八氢番茄红素合酶） 催化 类胡萝卜素合成第一步限速酶；其启动子经4M或6M突变后驱动表达
水稻胚性愈伤组织（Oryza sativa cv. Bomba） 类胡萝卜素生物合成 PDS PDS（八氢番茄红素脱饱和酶） 催化 共转化基因，由大麦D-hordein启动子驱动，用于将phytoene转化为ζ-胡萝卜素

关键发现

  1. 4M启动子驱动GFP表达，相对mRNA水平从0.1-0.2提高到0.8-1，GFP蛋白（27 kDa）在愈伤和T1种子中检测到
  2. 6M启动子使PSY1 mRNA水平比Na启动子平均高约2倍（p<0.05）
  3. 6M-PSY1共转化PDS使愈伤呈现深橙色，phytoene水平最高达7.13 μg/g DW（Co-79），β-胡萝卜素最高达39.17 μg/g DW（Co-79），Co-30和Co-80的β-胡萝卜素分别为12.7和12.62 μg/g DW
  4. 未校正的Na启动子或仅4M启动子驱动的PSY1未能积累类胡萝卜素

研究结论

修正近失配顺式元件可以将沉默的内源PSY1启动子转化为功能性胚乳/愈伤表达启动子，激活类胡萝卜素生物合成，验证了SLEEPER策略的有效性，为植物营养强化和代谢工程提供了新工具