Experimental validation of computationally predicted phytoene synthase isoforms encoded by the Arabidopsis thaliana PSY gene
- 作者
- Juan Navarro-Carcelen, Manuel Rodriguez-Concepcion
- 杂志
- Plant Cell Reports（2025）
- DOI
- 10.1007/s00299-025-03482-1
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
验证拟南芥中计算预测的PSY基因异构体是否具有真实的八氢番茄红素合酶活性，揭示TAIR数据库代表模型的准确性。
研究策略
采用植物（烟草瞬时表达）和细菌（大肠杆菌类胡萝卜素工程菌）两个系统，比较天然AtPSY和合成AtPSY^extra的体内活性，并通过免疫印迹和代谢物定量分析验证。
研究路线图
核心内容
该研究通过烟草瞬时表达和大肠杆菌类胡萝卜素工程菌两个系统，实验验证了拟南芥PSY基因计算预测异构体AtPSY^extra的酶活性，并检验TAIR数据库代表模型的准确性。PCR未能从拟南芥cDNA中扩增出编码AtPSY^extra的序列；在烟草叶片中，天然AtPSY表达的八氢番茄红素水平显著高于AtPSY^extra和PRK对照（p<0.05，三个独立重复），而AtPSY^extra与PRK对照无显著差异；免疫印迹排除了蛋白不积累的可能。在大肠杆菌中，仅pET32-AtPSY菌株产生β-胡萝卜素呈现橙色，pET32-AtPSY^extra菌株与仅含pAC-85b的对照无差别，检测不到β-胡萝卜素。AtPSY^extra额外编码15个氨基酸残基（VMLKVDFYKQSIVAL）。实验结果证实AtPSY^extra是计算预测伪影，缺乏八氢番茄红素合酶活性，TAIR中At5g17230.3作为代表模型需要修正，表明计算预测结果必须经过实验验证方可采信。
创新点
首次实验证明TAIR数据库选择为代表模型的At5g17230.3编码的AtPSY^extra蛋白缺乏酶活性，是计算预测伪影，强调实验验证的重要性。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana（烟草） | 类胡萝卜素生物合成途径 | At5g17230 | PSY | 催化 | 瞬时表达验证八氢番茄红素合成酶活性 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成途径（β-胡萝卜素工程菌） | At5g17230 | PSY | 催化 | 异源表达验证PSY活性 |
关键发现
- PCR未能从拟南芥cDNA中扩增出编码AtPSY^extra的序列
- 在烟草叶片中，AtPSY表达的八氢番茄红素水平显著高于AtPSY^extra和PRK对照（p<0.05，三个独立重复），而AtPSY^extra与PRK对照无显著差异
- 免疫印迹显示AtPSY^extra蛋白正常积累
- 在大肠杆菌中，仅pET32-AtPSY菌株产生β-胡萝卜素（橙色），pET32-AtPSY^extra菌株与仅含pAC-85b的对照无差别，无法检测到β-胡萝卜素。AtPSY^extra额外编码15个氨基酸残基（VMLKVDFYKQSIVAL）。NFZ处理浓度为2 μM。
研究结论
实验结果证实AtPSY^extra是计算预测伪影，不具有八氢番茄红素合酶活性，因此TAIR中At5g17230.3作为代表模型需要修正，这一结论强调计算预测必须经过实验验证。