Laboratory-Evolved Mutants of an Exogenous Global Regulator, IrrE from Deinococcus radiodurans, Enhance Stress Tolerances of Escherichia coli
- 作者
- Tingjian Chen, Jianqing Wang, Rong Yang, Jicong Li, Min Lin, Zhanglin Lin
- 单位
- Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing, China; Key Laboratory of Crop Biotechnology, Ministry of Agriculture, Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China
- 杂志
- PLoS ONE（2011）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0016228
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
工业微生物菌株对乙醇、丁醇、醋酸盐等胁迫的耐受性难以通过单基因操作有效提高，传统诱变方法效率低、耗时，亟需新的全局性菌株工程策略。
研究策略
以外源全局调控因子IrrE（来自耐辐射奇球菌）为靶点，通过易错PCR随机突变构建基因文库，在大肠杆菌中分别针对乙醇、丁醇和醋酸盐胁迫进行筛选，获得具有显著耐受性提高的突变体，并对其生长、存活、胞内ROS水平和突变位点进行分析。
研究路线图
核心内容
本研究以耐辐射奇球菌来源的全局调控因子IrrE为靶点，通过易错PCR构建随机突变文库，在大肠杆菌中针对乙醇、丁醇和醋酸盐胁迫进行定向筛选，获得多个耐受性显著提升的突变体。其中乙醇耐受突变体E1在5%乙醇中生长量较对照提高约48倍，12.5%乙醇休克后存活率提高近100倍；丁醇耐受突变体B29在0.625%丁醇中生长量提升约5倍，且对异丁醇、戊醇等表现出交叉耐受；醋酸盐耐受突变体A15在0.05%醋酸盐及低pH条件下均具生长优势。机制分析显示，突变体胞内ROS水平显著低于对照，且氨基酸突变分布于IrrE的N端、HTH及C端三个结构域。该工作首次实现外源全局调控因子经人工进化适应新宿主，为工业菌株耐受性改良提供了可独立应用或与全局转录机器工程（gTME）联用的新策略，对提高微生物发酵生产中的胁迫抗性具有重要参考价值。
创新点
首次将外源全局调控因子通过人工进化使其适应新宿主大肠杆菌，并成功提高多种胁迫耐受性；突变体耐受性的提高幅度大（2-50倍生长，10-100倍休克存活）；揭示了irrE突变跨三个结构域、胞内ROS水平显著降低等机制，为工业菌株耐受性改良提供了可单独或与gTME结合使用的新方法。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 全局胁迫响应/耐受调控网络 | irrE (DR0167) | IrrE | 调控 | 来自 Deinococcus radiodurans 的外源全局调控因子，随机突变后筛选获得耐受乙醇、丁醇、醋酸盐的突变体 |
| Escherichia coli DH5α | 乙醇耐受 | irrE E1 | IrrE E1 | 调控 | 乙醇耐受突变体，含4个氨基酸突变，分布在三个结构域，5%乙醇中OD600提高约48倍 |
| Escherichia coli DH5α | 丁醇耐受 | irrE B29 | IrrE B29 | 调控 | 丁醇耐受突变体，含3个错义突变A60V、A184T、G214S，0.625%丁醇中OD600提高约5倍 |
| Escherichia coli DH5α | 醋酸盐耐受 | irrE A15 | IrrE A15 | 调控 | 醋酸盐耐受突变体，含1个错义突变A178T（HTH域），同时对低pH也有耐受性 |
关键发现
- 获得乙醇耐受突变体E1、E28、E30、E79、E80，在5%乙醇中OD600比pMD18T对照提高最高约48倍（E1），4%乙醇中约3倍，3%乙醇中约1.6倍
- 5%乙醇休克1小时后存活率比野生型irrE高10倍以上，比pMD18T对照高近100倍。丁醇耐受突变体B29在0.625%丁醇中OD600比对照提高约5倍，在2.1%丁醇休克1小时后存活率提高约100倍
- 并且对异丁醇、戊醇、异戊醇也表现出交叉耐受。醋酸盐耐受突变体A15在0.05%醋酸盐中生长优势明显，且在pH4.5（HCl）条件下也生长更好。胞内ROS测定显示：E1在1.5%乙醇胁迫下荧光强度仅增加约53%，B29在0.25%丁醇胁迫下ROS水平也显著低于对照。突变体序列分析：乙醇突变体E1、E28、E30、E79、E80分别含4、2、2、4、4个氨基酸突变
- B29含3个错义突变A60V、A184T、G214S
- A15含1个错义突变A178T
- 所有突变分布在N端、HTH、C端三个结构域。
研究结论
通过随机突变并筛选外源全局调控因子IrrE，可显著提高大肠杆菌对乙醇、丁醇和醋酸盐等多种胁迫的耐受性，且突变体通过降低胞内ROS水平保护细胞。这是首次实现外源全局调控因子的人工进化以适应新宿主，该方法为工业菌株耐受性改良提供了新途径，可单独应用或与gTME等其他全局工程方法结合使用。