Molecular and biochemical characterization of an aminoalcoholphosphotransferase (AAPT1) from Brassica napus: effects of low temperature and abscisic acid treatments on AAPT expression in Arabidopsis plants and effects of over-expression of BnAAPT1 in transgenic Arabidopsis
- 作者
- Qungang Qi, Yong-fen Huang, Adrian J. Cutler, Suzanne R. Abrams, David C. Taylor
- 单位
- Plant Biotechnology Institute, National Research Council of Canada, 110 Gymnasium Place, Saskatoon, SK S7N 0W9, Canada; Biology Department, Harbin Normal University, 50 Hexing Road, 150080 Harbin, China
- 杂志
- Planta（2003）
- DOI
- 10.1007/s00425-003-1031-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
克隆并表征甘蓝型油菜氨基酸醇磷酸转移酶（AAPT1）基因，阐明其生化特性、底物偏好、催化关键基序，以及低温和ABA对其表达的影响，并评估过表达BnAAPT1对转基因拟南芥膜脂组成和冷耐受性的作用。
研究策略
从油菜cDNA文库中分离BnAAPT1，在AAPT缺陷酵母菌株HJ091中异源表达以测定酶活和动力学；通过扫描丙氨酸突变分析保守CDP-醇磷酸转移酶基序；在拟南芥中利用双35S启动子过表达BnAAPT1，分析转录水平、CPT酶活、膜脂及脂肪酸组成，并进行低温处理试验。
研究路线图
核心内容
该研究从甘蓝型油菜中克隆了编码氨基酸醇磷酸转移酶的BnAAPT1基因，并在酵母AAPT缺陷菌株中异源表达以表征其生化功能。酶动力学显示该酶偏好CDP-胆碱（Km为32 μM）而非CDP-乙醇胺（Km为127 μM），且以CDP-胆碱为底物时活性高出近两倍。定点突变分析鉴定出保守CDP-醇磷酸转移酶基序中的Asp117和Asp121为催化必需残基，突变后完全失活。在拟南芥中过表达BnAAPT1使CPT酶活提高2至3.5倍，显著改变膜脂组成：叶片18:2含量从9.4增至13.9 mol%，叶绿体膜PC增加18%至20%，非叶绿体膜PC增加20%，多不饱和脂肪酸总和增加约25%。低温处理试验表明，转基因株系在2°C下干重损失仅为野生型的约60%，叶绿素保留能力更强，表现出明显增强的冷耐受性。此外，低温和ABA处理均可诱导拟南芥内源AAPT转录。这些结果证明BnAAPT1通过Kennedy途径调节膜磷脂组成，其过表达改善膜流动性进而提升植物抗寒性，为理解植物低温适应机制提供了分子依据。
创新点
首次对植物AAPT的CDP-醇磷酸转移酶基序进行系统的定点突变研究，证明该基序对催化活性至关重要，且Asp117和Asp121为关键催化残基；证实BnAAPT1为双功能酶但偏好CDP-胆碱；揭示低温和ABA可诱导拟南芥AAPT转录；过表达BnAAPT1可显著增加膜磷脂酰胆碱（PC）和多不饱和脂肪酸比例，并增强转基因拟南芥的冷耐受性。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母菌株HJ091（AAPT缺陷） | Kennedy途径（CDP-胆碱/CDP-乙醇胺途径） | BnAAPT1（来自甘蓝型油菜） | BnAAPT1（氨基酸醇磷酸转移酶） | 催化 | 异源表达用于酶学表征、动力学及定点突变研究 |
| 酿酒酵母菌株HJ091 | Kennedy途径 | CPT1、EPT1（内源基因） | 酵母CPT1、EPT1 | 催化 | AAPT缺陷菌株，作为功能互补和底物特异性对照 |
| 拟南芥（Columbia生态型） | Kennedy途径 | BnAAPT1（外源过表达） | BnAAPT1 | 催化 | 双35S启动子驱动过表达，T3代转基因株系用于脂质和冷耐受分析 |
| 拟南芥（Columbia生态型） | Kennedy途径 | AtAAPT1、AtAAPT2 | AtAAPT1p/AtAAPT2p | 催化 | 内源AAPT基因，其转录受低温和ABA诱导 |
关键发现
- BnAAPT1对CDP-胆碱的表观Km为32 μM，Vmax为35 nmol PC·h⁻¹·mg⁻¹蛋白
- 对CDP-乙醇胺的Km为127 μM，Vmax为13 nmol PE·h⁻¹·mg⁻¹蛋白
- 使用CDP-乙醇胺时的活性仅为CDP-胆碱的36%。5 mM Mg²⁺和Mn²⁺分别使酶活提高34%和25%，2 mM Ca²⁺抑制34%，磷脂混合物提高31%。定点突变显示Asp99→Ala保留86%活性，Gly100→Ala保留22%，Ala103→Gly保留56%，Arg104→Ala保留35%，Gly113→Ala保留12%，而Asp117→Ala和Asp121→Ala完全丧失活性。在转基因拟南芥中，4个高表达株系（S12、S13、S24、S37）的CPT酶活较对照提高2-3.5倍
- S37叶片18:2含量从9.4增至13.9 mol%（+47%），绿色角果18:3从21.8增至26.9 mol%（+23%），22:1从3.7增至15.8 mol%，成熟种子20:1从7.5增至12 mol%
- 叶绿体膜PC增加18-20%，PG降低15-25%
- 非叶绿体膜PC在S37中从37.4增至45.1 mol%（+20%），PA降低38%
- [18:2+18:3]总和增加约25%。冷处理（2°C 20天）后，野生型干重降低13倍，转基因株系降低8倍
- 野生型叶绿素降低2.3倍，转基因株系降低1.5倍
- 转基因植株较野生型干重高2倍、叶绿素高1.6倍。低温和ABA处理均诱导拟南芥内源AAPT转录。
研究结论
BnAAPT1是甘蓝型油菜中具有双功能催化活性的氨基酸醇磷酸转移酶，主要通过Kennedy途径催化PC和PE合成，且明显偏好CDP-胆碱。其保守的CDP-醇磷酸转移酶基序是催化活性必需的，其中Asp117和Asp121为关键残基。植物AAPT基因表达受低温和ABA的正向调控，过表达BnAAPT1可提高膜PC和多不饱和脂肪酸含量，改善膜流动性，从而增强拟南芥幼苗的低温耐受性。这些结果支持AAPT在植物低温适应和脂质代谢调控中发挥重要作用。