Nicotiana benthamiana as a Production Platform for Artemisinin Precursors
- 作者
- Teun W. J. M. van Herpen, Katarina Cankar, Marilise Nogueira, Dirk Bosch, Harro J. Bouwmeester, Jules Beekwilder
- 单位
- Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands; Plant Research International, Wageningen, The Netherlands; Department of Chemistry, Utrecht University, Utrecht, The Netherlands
- 杂志
- PLoS ONE（2010）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0014222
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用植物Nicotiana benthamiana作为快速生产青蒿素前体（青蒿酸等）的平台，以解决青蒿素来源不足和成本问题。
研究策略
通过农杆菌浸润（agroinfiltration）在N. benthamiana叶片中瞬时表达多基因构建体，利用2A核糖体跳跃序列实现单开放阅读框多基因共表达，并将关键酶靶向线粒体以增加前体供给；结合非靶向代谢组学分析产物。
研究路线图
核心内容
本研究以烟草（Nicotiana benthamiana）为底盘，通过农杆菌浸润瞬时表达青蒿素生物合成相关基因，探索快速生产青蒿素前体的可行性。研究者利用2A核糖体跳跃序列实现单开放阅读框内多基因共表达，并将关键酶靶向线粒体以增加前体供给。单独表达amorpha-4,11-diene合酶时产量仅0.9 mg/kg鲜重，而共表达线粒体靶向的法尼基焦磷酸合酶和截短HMG-CoA还原酶后，amorpha-4,11-diene产量提升至6.2 mg/kg鲜重，且共表达tHMGR可令产量提高300–400倍。进一步引入CYP71AV1氧化酶后，amorpha-4,11-diene含量降低31倍，同时意外检测到青蒿酸-12-β-二葡萄糖苷以39.5 mg/kg鲜重积累（相当于16.6 mg/kg青蒿酸），表明宿主内源糖基转移酶将异源生成的青蒿酸高效修饰为糖苷。该工作证实农杆菌浸润烟草可作为倍半萜药物前体研究的快速模型，同时揭示异源途径与宿主内源代谢的互作是植物代谢工程不可忽视的因素。
创新点
采用2A核糖体跳跃技术实现ADS、FPS和HMGR的单ORF共表达；将ADS和FPS线粒体靶向以提高amorpha-4,11-diene产量；通过非靶向LC-QTOF-MS发现青蒿酸被内源糖基转移酶修饰为青蒿酸-12-β-二葡萄糖苷这一意外产物。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素生物合成（倍半萜合成） | ADS | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 催化FPP转化为amorpha-4,11-diene，线粒体靶向表达 |
| Nicotiana benthamiana | 甲羟戊酸途径 | tHMGR | 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase | 催化 | 截短型HMGR，细胞质表达，提高IPP/DMAPP供给，显著促进amorphadiene积累 |
| Nicotiana benthamiana | 萜类前体生物合成 | FPS (FPS2) | farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 线粒体靶向，催化IPP和DMAPP生成FPP，为ADS提供底物 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素生物合成（氧化步骤） | CYP71AV1 | amorphadiene oxidase (cytochrome P450) | 催化 | 催化amorpha-4,11-diene氧化生成青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸 |
| Nicotiana benthamiana | 内源糖基化修饰 | — | 内源UDP-葡萄糖基转移酶（推测含TOGT1同源物） | 催化 | 将青蒿酸糖基化为青蒿酸-12-β-二葡萄糖苷 |
| Nicotiana benthamiana | 亚细胞定位 | COX IV | 细胞色素c氧化酶IV亚基线粒体靶信号 | 区室化 | 用于将ADS和FPS靶向线粒体，提高FPP可利用性 |
关键发现
- 单独表达35S-mA产生amorpha-4,11-diene 0.9 mg/kg fwt，而35S-mAmFH-2A产生6.2 mg/kg fwt，未知化合物20.8 mg/kg fwt
- 共浸润CYP71AV1后amorpha-4,11-diene降低31倍至0.2 mg/kg fwt，未知化合物降至1.7 mg/kg fwt，同时积累青蒿酸-12-β-二葡萄糖苷39.5 mg/kg fwt（对应青蒿酸16.6 mg/kg fwt）
- 头部空间排放amorpha-4,11-diene量为0.70 mg/kg fwt·24h-1
- 单独表达RBC-mA产生0.011 mg/kg fwt amorphadiene，共表达tHMGR提高300-400倍至3.2 mg/kg fwt。
研究结论
农杆菌浸润N. benthamiana可作为研究倍半萜药物前体生产的快速模型；异源途径引入的青蒿酸会被N. benthamiana内源糖基转移酶高效转化为青蒿酸-12-β-二葡萄糖苷，表明异源途径与宿主内源代谢的互作是植物代谢工程的重要考量因素。