Proteome analysis of the medicinal plant Catharanthus roseus
- 作者
- Denise I. Jacobs, Marco Gaspari, Jan van der Greef, Robert van der Heijden, Robert Verpoorte
- 杂志
- Planta（2005）
- DOI
- 10.1007/s00425-004-1474-4
- 所属领域
- 植物次生代谢/蛋白质组学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
鉴定药用植物长春花（Catharanthus roseus）中参与萜类吲哚生物碱生物合成的新蛋白质。
研究策略
利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）分离长春花A11细胞系生长周期中的蛋白质，结合MALDI-MS/MS质谱鉴定，并通过比较不同时间点蛋白质表达谱筛选与生物碱积累相关的蛋白。
核心内容
本研究以药用植物长春花（Catharanthus roseus）细胞系A11为材料，利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）分离培养生长周期中的全蛋白组，并结合MALDI-MS/MS质谱进行蛋白质鉴定，通过比较不同时间点表达谱筛选与萜类吲哚生物碱积累相关的候选蛋白。研究发现，培养21天内马钱子苷、阿吗碱和文多灵碱等生物碱含量在第3至6天快速上升，第16天达峰值；第9天检测到最大蛋白斑点数（平均905个，最多988个）。从88个差异蛋白点中成功鉴定58个，包括两个异胡豆苷合成酶异构体、色氨酸合成酶β链和12-氧代植二烯酸还原酶等，其中部分蛋白经de novo测序确认。还发现若干在数据库中无同源匹配的独特序列，可能代表未知的生物合成相关蛋白。该工作证明在缺乏基因组信息时，蛋白质组学策略可高效鉴定次生代谢相关蛋白，所得候选蛋白为后续基因克隆和代谢工程改造提供了重要靶点。
创新点
将蛋白质组学技术系统应用于长春花生物碱生物合成研究；在缺乏基因组序列信息的情况下，采用MS/MS测序和de novo测序成功鉴定多个与生物碱合成相关的蛋白；发现多个独特序列，为后续基因克隆和代谢工程提供候选靶点。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus 细胞系 A11 | 萜类吲哚生物碱生物合成 | — | strictosidine synthase（马钱子苷合成酶） | 催化 | 催化色胺和裂环马钱素缩合形成strictosidine，EC 4.3.3.2；鉴定到两个亚型（S1、S2 selection） |
| Catharanthus roseus 细胞系 A11 | 色氨酸生物合成 | — | tryptophan synthase β-chain（色氨酸合成酶β链） | 催化 | 为生物碱合成提供前体色胺，EC 4.1.1.28；短期诱导表达（第9天大量出现） |
| Catharanthus roseus 细胞系 A11 | 茉莉酸生物合成 | — | 12-oxophytodienoate reductase（12-氧代植二烯酸还原酶） | 催化 | 催化茉莉酸生物合成最后一步，间接参与生物碱合成调控 |
| Catharanthus roseus 细胞系 A11 | 丝氨酸生物合成 | — | phosphoglycerate dehydrogenase（磷酸甘油酸脱氢酶） | 催化 | 通过3-磷酸甘油酸途径参与丝氨酸合成，可能为色氨酸合成提供底物 |
| Catharanthus roseus 细胞系 A11 | 糖酵解/萜类前体合成 | — | triose phosphate isomerase（磷酸丙糖异构酶） | 催化 | 催化磷酸二羟丙酮与3-磷酸甘油醛互变，与MEP途径提供异戊烯基二磷酸前体相关 |
| Catharanthus roseus 细胞系 A11 | 三羧酸循环/乙醛酸循环 | — | malate dehydrogenase（苹果酸脱氢酶） | 催化 | 两个蛋白点（610、611）符合S1表达模式 |
| Catharanthus roseus 细胞系 A11 | 三羧酸循环 | — | aconitase（乌头酸酶） | 催化 | 仅在第9天大量检测到，可能有其他亚型 |
| Catharanthus roseus 细胞系 A11 | 氧化磷酸化 | — | ATP synthase α/β chain（ATP合酶亚基） | 能量供给 | 提供细胞能量，表达量基本恒定 |
| Catharanthus roseus 细胞系 A11 | 甘氨酸脱羧系统 | — | H-protein（H蛋白） | 催化 | 甘氨酸脱羧复合体亚基，将甘氨酸转化为丝氨酸 |
| Catharanthus roseus 细胞系 A11 | 光合作用/卡尔文循环 | — | ribulose bisphosphate carboxylase (Rubisco) | 催化 | 参与CO2固定，表明细胞系可能具有光合活性 |
关键发现
长春花细胞系A11培养21天，生物碱（马钱子苷、阿吗碱、文多灵碱）含量在第3-6天快速增加，第16天达到最大值。第9天检测到最多蛋白质斑点（平均905个，最大988个）。共选取88个蛋白质点进行质谱鉴定，其中58个被成功鉴定（56个通过数据库检索，2个通过de novo测序），包括两个strictosidine synthase异构体、色氨酸合成酶β链、12-氧代植二烯酸还原酶等。通过表达谱筛选，S1 selection含56个蛋白点，S2 selection含55个蛋白点。发现的独特序列未在数据库中获得同源匹配，可能代表未知的生物合成相关蛋白。
研究结论
蛋白质组学方法（2D-PAGE结合质谱）能够在缺乏基因组序列信息的情况下有效鉴定长春花中参与次生代谢的蛋白质，发现的候选蛋白（尤其是无同源性的独特序列）可作为进一步基因克隆和代谢工程的目标。