Characterization of a β-carotene hydroxylase of Adonis aestivalis and its expression in Arabidopsis thaliana
- 作者
- Bianyun Yu, Derek J. Lydiate, Ulrike A. Schafer, Abdelali Hannoufa
- 杂志
- Planta（2006）
- DOI
- 10.1007/s00425-006-0455-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从 Adonis aestivalis 中克隆并鉴定β-胡萝卜素羟化酶基因 CrtH1，并在拟南芥中异源表达以改变类胡萝卜素（尤其是叶黄素类）的合成，为植物类胡萝卜素代谢工程提供工具。
研究策略
基于保守序列设计简并引物克隆 CrtH1 cDNA；通过 E. coli 功能互补试验验证其β-胡萝卜素羟化酶活性；利用种子特异性 napin 启动子在拟南芥野生型和 b1b2 双突变体中表达 CrtH1，分析种子类胡萝卜素组成变化。
核心内容
从夏侧金盏花（Adonis aestivalis）中克隆了β-胡萝卜素羟化酶基因CrtH1，并通过大肠杆菌功能互补试验证实其编码的酶能将β-胡萝卜素转化为玉米黄质。该cDNA编码309个氨基酸的蛋白，与植物β-胡萝卜素羟化酶同源性约70%。在大肠杆菌中表达时，β-隐黄质和玉米黄质分别占总可检测类胡萝卜素的24.5%和38.9%，表明该酶具有不对称羟基化活性。Southern印迹显示CrtH1在夏侧金盏花基因组中属于至少3个成员的多基因家族，且在花瓣、根和茎中高表达。利用种子特异性napin启动子将CrtH1在拟南芥野生型和b1b2双突变体中异源表达，野生型种子violaxanthin含量提高至10倍；在b1b2突变体背景下，BY317株系violaxanthin含量达24.741 μg/g干重，较突变体（0.881 μg/g）增加27倍。多数转基因株系叶黄素增加14–72%，β-胡萝卜素减少15–78%。结果表明CrtH1可有效催化类胡萝卜素羟化，为油料作物类胡萝卜素代谢工程提供了可用工具。
创新点
首次从 Adonis aestivalis 中克隆β-胡萝卜素羟化酶 CrtH1；发现其在 E. coli 中不对称羟基化生成大量β-隐黄质；在拟南芥种子中异源表达可显著提高 violaxanthin 含量，最高达 27 倍。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Adonis aestivalis | 类胡萝卜素生物合成 | CrtH1 | β-胡萝卜素羟化酶 CrtH1 | 催化 | 从花瓣中克隆，具有4个保守组氨酸基序和质体转运肽，催化β-胡萝卜素羟基化生成β-隐黄质和玉米黄质 |
| Escherichia coli JM101 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→玉米黄质） | CrtH1 | β-胡萝卜素羟化酶 CrtH1 | 催化 | 与 pACCAR16ΔcrtX 共表达，证明 CrtH1 可将β-胡萝卜素转化为β-隐黄质和玉米黄质 |
| Escherichia coli JM101 | β-胡萝卜素生物合成 | pACCAR16ΔcrtX 携带的类胡萝卜素合成基因 | — | 催化 | 来源于 Erwinia uredovora，提供β-胡萝卜素合成途径，用于 CrtH1 功能分析 |
| Arabidopsis thaliana (野生型 Wassilewskija) | 类胡萝卜素生物合成 | CrtH1 | β-胡萝卜素羟化酶 CrtH1 | 催化 | 在种子特异性 napin 启动子控制下表达，导致 violaxanthin 含量增加最多达10倍 |
| Arabidopsis thaliana b1b2 突变体 | 类胡萝卜素生物合成 | b1, b2 | 内源β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | T-DNA 敲除内源β-胡萝卜素羟化酶基因的突变体，表达 CrtH1 后 violaxanthin 增加最高达27倍 |
| Brassica napus | 种子特异性表达 | napin 启动子 | — | 调控 | 用于驱动 CrtH1 在拟南芥种子中特异性表达 |
关键发现
- CrtH1 cDNA 编码 309 个氨基酸的预测蛋白，分子量约 35 kDa，pI
- 15；与植物β-胡萝卜素羟化酶氨基酸一致性约 70%。在 E. coli 功能分析中，β-隐黄质和玉米黄质分别占总可检测类胡萝卜素的
- 5%(±0.4%) 和
- 9%(±0.7%)。Southern 印迹表明 CrtH1 在 A. aestivalis 基因组中属于至少 3 个成员的多基因家族；Northern 印迹显示其在花瓣、根和茎中高表达，在叶片和发育种子中低表达。在拟南芥野生型中表达 CrtH1 使 violaxanthin 含量增加至 10 倍；在 b1b2 突变体中 BY317 株系 violaxanthin 含量为
- 741 μg/g 干重，较 b1b2 突变体（0.881 μg/g 干重）增加 27 倍。大多数 b1b2 突变体转基因株系叶黄素增加 14-72%，大多数转基因株系β-胡萝卜素减少 15-78%。
研究结论
CrtH1 编码β-胡萝卜素羟化酶，能够将β-胡萝卜素转化为玉米黄质，在 E. coli 和拟南芥中均有功能；CrtH1 可用于十字花科油料作物等高等植物类胡萝卜素生物合成的代谢工程改造。