Molecular cloning and functional characterization of α-humulene synthase, a possible key enzyme of zerumbone biosynthesis in shampoo ginger (Zingiber zerumbet Smith)
- 作者
- Fengnian Yu, Sho Okamoto, Kaoru Nakasone, Kyoko Adachi, Satoru Matsuda, Hisashi Harada, Norihiko Misawa, Ryutaro Utsumi
- 单位
- Department of Bioscience, Graduate School of Agriculture, Kinki University, 3327-204 Nakamachi, Nara 631-8505, Japan; Department of Biotechnology and Chemistry, Graduate School of Engineering, Kinki University, Higashihiroshima, Hiroshima 739-2116, Japan; Marine Biotechnology Institute, Heita, Kamaishi, Iwate 026-0001, Japan
- 杂志
- Planta（2008）
- DOI
- 10.1007/s00425-008-0700-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析洗发姜（Zingiber zerumbet）中zerumbone生物合成的关键酶——α-humulene合酶，并实现其在大肠杆菌中的异源表达与产物生产。
研究策略
利用简并PCR和RACE技术从根茎中克隆ZSS1 cDNA；在大肠杆菌中异源表达并纯化重组酶，以FPP为底物进行体外酶活测定和GC-MS产物鉴定；通过共表达外源甲羟戊酸途径基因与ZSS1，在工程大肠杆菌中实现α-humulene的体内生产；并用RT-PCR和实时定量PCR分析组织表达和诱导模式。
核心内容
该研究从洗发姜根茎中克隆了编码α-humulene合酶的ZSS1基因，其开放阅读框长1,644 bp，编码548个氨基酸。重组酶经大肠杆菌异源表达纯化后，以法尼基焦磷酸为底物进行体外酶活测定，GC-MS分析表明其主要产物为α-humulene（占95%），副产物为β-caryophyllene（占5%）。研究还发现ZSS1属于TPS-III亚家族，具有7外显子6内含子的基因结构。通过将ZSS1与来源于链霉菌的甲羟戊酸途径基因共表达于大肠杆菌，成功实现了α-humulene的体内合成。组织表达分析显示ZSS1转录在根茎中高水平表达，叶片中较低，茎中不表达；经茉莉酸甲酯处理48小时后叶片中表达量升高约8倍。研究结果说明ZSS1是zerumbone生物合成的关键酶，其在大肠杆菌中的成功表达为zerumbone的微生物合成奠定了基础，同时ZSS1受茉莉酸甲酯诱导的特性提示其可能在植物防御反应中发挥作用。
创新点
['首次从洗发姜中克隆并功能鉴定了以α-humulene为主要产物的倍半萜合酶基因ZSS1', '发现ZSS1属于TPS-III亚家族，具有7外显子6内含子结构', '通过导入外源甲羟戊酸途径，成功在大肠杆菌中实现α-humulene的体内生产，为zerumbone的微生物合成奠定基础']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | HMGS, HMGR, MK, PMK, MPD, IPPI | HMGS, HMGR, MK, PMK, MPD, IPPI | 催化 | 来自Streptomyces sp. CL190，将甲羟戊酸转化为IPP和DMAPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | α-humulene合成途径 | ZSS1 | α-humulene合酶 | 催化 | 催化FPP环化生成α-humulene（95%）和β-caryophyllene（5%） |
| Zingiber zerumbet Smith | zerumbone生物合成途径 | ZSS1 | α-humulene合酶 | 催化 | 主要在根茎中表达，受MeJA诱导，可能参与zerumbone前体合成 |
关键发现
- ['ZSS1 cDNA开放阅读框长1,644 bp，编码548个氨基酸，预测分子量64.5 kDa，等电点5.25', 'ZSS1氨基酸序列与已知倍半萜合酶一致性为34%-63%，与生姜germacrene D合酶相似性最高（63%）', '重组ZSS1酶催化FPP生成α-humulene（95%）和β-caryophyllene（5%）', '将ZSS1与来自Streptomyces sp. CL190的甲羟戊酸途径基因共表达于E. coli，成功检测到α-humulene的体内合成', 'ZSS1转录在根茎中高水平表达，叶片中较低，茎中不表达
- MeJA处理48h后叶片中表达量升高约8倍，根茎中24h升高2-3倍', '文献报道根茎油中α-humulene含量为14.4%，叶油中为2.0%，与ZSS1表达水平一致']
研究结论
ZSS1编码的α-humulene合酶是zerumbone生物合成的关键酶；通过大肠杆菌代谢工程可实现α-humulene的生产，这是向zerumbone微生物合成迈出的重要一步；ZSS1的表达受MeJA诱导，可能在植物防御中发挥作用。