Reconstitution of the Costunolide Biosynthetic Pathway in Yeast and Nicotiana benthamiana
- 作者
- Qing Liu, Mohammad Majdi, Katarina Cankar, Miriam Goedbloed, Tatsiana Charnikhova, Francel W. A. Verstappen, Ric C. H. de Vos, Jules Beekwilder, Sander van der Krol, Harro J. Bouwmeester
- 单位
- Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands; Agronomy and Plant Breeding Department, Faculty of Agriculture, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran; Plant Research International, Wageningen, The Netherlands; Centre for BioSystems Genomics, Wageningen, The Netherlands; Netherlands Metabolomics Centre, Leiden, The Netherlands
- 杂志
- PLoS ONE（2011）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0023255
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
costunolide生物合成途径中最后一步（由germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-oic acid生成costunolide）对应的基因尚未被鉴定，且该途径在异源宿主中的重构尚未实现。
研究策略
从菊苣（Cichorium intybus）cDNA文库中筛选5个候选CYP71 P450基因，通过共表达已知的TpGAS（feverfew来源）与CiGAO（chicory来源）构建酵母和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中的costunolide生物合成途径，并利用GC-MS和LC-MS分析产物。
研究路线图
核心内容
本研究首次鉴定并功能表征了菊苣来源的costunolide合成酶基因CiCOS（CYP71BL3），补齐了costunolide生物合成途径中最后一步的关键酶。通过共表达 feverfew 来源的TpGAS、菊苣来源的CiGAO与CiCOS，在酵母和本氏烟草中成功重构完整途径。线粒体靶向的mTpGAS使烟草中germacrene A产量较胞质形式提高约15倍。在酵母中，使用MOPS缓冲液替代HEPES后，costunolide产量从9 μg/mL提升至约28 μg/mL培养物。烟草叶片共浸润表达三种基因后，平均产量为48.6±13.4 ng/g鲜重。此外，在烟草中检测到costunolide与谷胱甘肽和半胱氨酸的自发结合产物，提示植物中costunolide可能以结合态储存。该工作不仅补全了途径基因，还通过亚细胞靶向和缓冲液优化显著提升异源产量，为倍半萜内酯类化合物的微生物与植物底盘生产提供了策略参考。
创新点
首次鉴定并功能表征了菊苣costunolide合成酶（CiCOS，CYP71BL3）；在酵母和本氏烟草中成功重构完整的costunolide生物合成途径；发现线粒体靶向TpGAS可显著提高germacrene A产量；首次报道costunolide在植物体内生成谷胱甘肽和半胱氨酸结合物。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (WAT11) | costunolide biosynthesis | TpGAS | Germacrene A synthase | 催化 | 来自Tanacetum parthenium (feverfew)；催化FPP生成germacrene A；活性比菊苣CiGAS高约3倍 |
| Saccharomyces cerevisiae (WAT11) | costunolide biosynthesis | CiGAO | Germacrene A oxidase | 催化 | 来自Cichorium intybus；催化germacrene A氧化为germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-oic acid |
| Saccharomyces cerevisiae (WAT11) | costunolide biosynthesis | CiCOS | Costunolide synthase (CYP71BL3) | 催化 | 来自Cichorium intybus；催化germacra-1(10),4,11(13)-trien-12-oic acid生成costunolide |
| Nicotiana benthamiana | costunolide biosynthesis | TpGAS | Germacrene A synthase | 催化 | 线粒体靶向信号(CoxIV)与TpGAS融合后(mTpGAS)，germacrene A产量比胞质形式高约15倍 |
| Nicotiana benthamiana | costunolide biosynthesis | CiGAO | Germacrene A oxidase | 催化 | 与mTpGAS共表达时，germacrene A几乎完全消失，表明被高效氧化 |
| Nicotiana benthamiana | costunolide biosynthesis | CiCOS | Costunolide synthase (CYP71BL3) | 催化 | 与mTpGAS和CiGAO共表达时，costunolide产量平均48.6±13.4 ng/g FW，最高60 ng/g FW |
关键发现
- TpGAS在酵母中产生germacrene A的活性约为菊苣CiGAS的3倍。在烟草中，线粒体靶向的mTpGAS使germacrene A产量比胞质cTpGAS高约15倍。酵母中共表达TpGAS、CiGAO和CiCOS时，在HEPES缓冲液（pH
- 5）中costunolide产量为9 μg/mL培养物，改用MOPS缓冲液（pH
- 5）后产量提高至约3倍（28 μg/mL培养物）。在本氏烟草叶片中共浸润表达mTpGAS、CiGAO和CiCOS，8次实验平均costunolide产量为48.6±13.4 ng/g鲜重，最高可达60 ng/g鲜重。此外，在烟草中共表达这三种基因时，检测到两种新化合物，经LC-MS/MS鉴定为costunolide-谷胱甘肽（m/z
- 2206）和costunolide-半胱氨酸（m/z
- 1615）结合物，且体外实验表明两者均可自发形成。
研究结论
首次鉴定并表征了菊苣costunolide合成酶基因CiCOS（CYP71BL3），并在酵母和本氏烟草中成功重构costunolide生物合成途径。线粒体靶向策略可显著提高萜类中间体产量。costunolide与谷胱甘肽/半胱氨酸的自发结合为植物中costunolide的储存和药物水溶性改良提供了新思路。