Construction and analysis of EST libraries of the trans-polyisoprene producing plant, Eucommia ulmoides Oliver
- 作者
- Nobuaki Suzuki, Hirotaka Uefuji, Takashi Nishikawa, Yukio Mukai, Atsushi Yamashita, Masahira Hattori, Naotake Ogasawara, Takeshi Bamba, Ei-ichiro Fukusaki, Akio Kobayashi, Yoshiyuki Ogata, Nozomu Sakurai, Hideyuki Suzuki, Daisuke Shibata, Yoshihisa Nakazawa
- 单位
- Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka University, Suita, Osaka 565-0871, Japan; Technical Research Institute, Hitachi Zosen Corporation, Osaka 565-0871, Japan; Department of Bioscience, Nagahama Institute of Bio-Science and Technology, 1266 Tamura, Nagahama 526-0829, Japan; Kitasato Institute for Life Sciences, Kitasato University, 1-15-1 Kitasato, Sagamihara, Kanagawa 228-8555, Japan; Department of Information Systems, Graduate School of Information Science, Nara Institute of Science and Technology, 8916-5 Takayama, Ikoma, Nara 630-0101, Japan; Kazusa DNA Research Institute, Kisarazu, Chiba 292-0818, Japan
- 杂志
- Planta（2012）
- DOI
- 10.1007/s00425-012-1679-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
反式聚异戊二烯橡胶生物合成机制尚不清楚，缺乏杜仲中相关基因和分子调控信息，阻碍了对其合成途径的理解和代谢工程改造。
研究策略
构建杜仲茎外层（OT）和内层（IT）组织的cDNA文库，进行大规模EST测序与组装；通过BLAST比对和Gene Ontology进行功能注释；分离异戊二烯生物合成相关基因的全长cDNA；利用酿酒酵母相应突变体进行功能互补验证；通过实时荧光定量PCR（qPCR）分析候选基因在不同组织中的表达模式。
核心内容
本研究以产反式聚异戊二烯橡胶的杜仲为对象，针对其橡胶生物合成机制不清、基因信息匮乏的问题，构建了茎外层和内层组织的cDNA文库并开展大规模EST测序。共获得27,752条高质量EST，组装为10,520个unigenes，其中74.8%与nr数据库有显著匹配，并鉴定出大量主要乳胶蛋白和金属硫蛋白同源基因。通过功能注释与筛选，分离了甲羟戊酸途径和DXP途径多个基因以及6个FPP合酶类似基因（EuTIDS1-6）。利用酿酒酵母突变体互补实验证实EuACAT1、EuHMGS1、EuMVK1、EuMVD1、EuIDI1、EuTIDS2和EuTIDS4等8个基因的酶学功能，而EuTIDS1、3、5因含有独特的六个氨基酸插入且不能互补酵母erg20突变体，被推测为长链trans-异戊二烯基二磷酸合酶候选基因。qPCR显示各EuTIDS基因在不同组织中表达模式差异明显，其中EuTIDS1在成熟叶中高表达。该研究为杜仲反式聚异戊二烯橡胶合成途径的解析和代谢工程改造提供了重要的基因资源和候选靶点。
创新点
['首次对杜仲茎组织构建了两个cDNA文库并产生27,752条高质量EST，组装成10,520个unigenes，为反式聚异戊二烯研究提供了丰富转录组资源', '从杜仲中分离得到5个FPP合酶类似基因（EuTIDS1-5），其中EuTIDS1、3、5具有独特的六个氨基酸插入且不能互补酵母erg20突变体，被提出为长链trans-异戊二烯基二磷酸合酶候选，可能参与高相对分子质量反式聚异戊二烯橡胶合成', '通过酵母功能互补实验证实了8个杜仲异戊二烯途径基因（EuACAT1、EuACAT2、EuHMGS1、EuMVK1、EuMVD1、EuIDI1、EuTIDS2、EuTIDS4）的酶学功能']
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 甲羟戊酸途径 (MVA pathway) | EuACAT1, EuACAT2 | 乙酰辅酶A乙酰转移酶 | 催化 | 催化两分子乙酰CoA缩合为乙酰乙酰CoA，为MVA途径第一步；两个基因均能互补酵母erg10突变体 |
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 甲羟戊酸途径 (MVA pathway) | EuHMGS1, EuHMGS2 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶 (HMG-CoA synthase) | 催化 | 催化乙酰乙酰CoA与乙酰CoA缩合生成HMG-CoA；EuHMGS1能互补酵母erg13突变体，EuHMGS2不能 |
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 甲羟戊酸途径 (MVA pathway) | EuHMGR1, EuHMGR2 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 (HMG-CoA reductase) | 催化 | 催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸，是MVA途径关键限速酶；未进行酵母互补实验 |
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 甲羟戊酸途径 (MVA pathway) | EuMVK1 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 催化甲羟戊酸磷酸化；能互补酵母erg12突变体 |
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 甲羟戊酸途径 (MVA pathway) | EuMVD1 | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 | 催化 | 催化甲羟戊酸二磷酸脱羧生成IPP；能互补酵母mvd1突变体 |
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 甲羟戊酸途径 (MVA pathway) | EuIDI1 | 异戊烯基二磷酸异构酶 (IPP isomerase) | 催化 | 催化IPP与DMAPP互变；能互补酵母idi1突变体 |
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 甲基赤藓醇磷酸途径 (MEP pathway) | EuDXS1, EuDXS2, EuDXS3, EuDXS4 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (DXP synthase) | 催化 | MEP途径第一步酶，催化丙酮酸与甘油醛-3-磷酸缩合；未进行酵母互补实验 |
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 异戊二烯基二磷酸合成 (trans-isoprenyl diphosphate biosynthesis) | EuTIDS2, EuTIDS4 | 法尼基二磷酸合酶 (FPP synthase) | 催化 | 催化IPP与DMAPP缩合生成FPP；能互补酵母erg20突变体，属于AtFPS1/2分支 |
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 异戊二烯基二磷酸合成 (trans-isoprenyl diphosphate biosynthesis) | EuTIDS1, EuTIDS3, EuTIDS5 | FPP合酶类似蛋白 (FPP synthase-like) | 催化 | 均含DDXXD基序，但具有额外6个氨基酸插入，不能互补酵母erg20突变体，可能为长链trans-异戊二烯基二磷酸合酶 |
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 异戊二烯基二磷酸合成 (trans-isoprenyl diphosphate biosynthesis) | EuTIDS6 | 牻牛儿基二磷酸合酶 (GPP synthase) | 催化 | 推定的GPP合酶，未进行酵母互补实验 |
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 异戊二烯基二磷酸合成 (trans-isoprenyl diphosphate biosynthesis) | EuTIDS7 | 牻牛儿基二磷酸合酶小亚基 (GPP synthase small subunit) | 催化 | 推定的GPP合酶小亚基，未进行酵母互补实验 |
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 异戊二烯基二磷酸合成 (trans-isoprenyl diphosphate biosynthesis) | EuTIDS8 | 牻牛儿基二磷酸合酶大亚基/牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶 (GPP synthase large subunit/GGPP synthase) | 催化 | 推定的GPP合酶大亚基或GGPP合酶，未进行酵母互补实验 |
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 异戊二烯基二磷酸合成 (trans-isoprenyl diphosphate biosynthesis) | EuTIDS9 | 牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶相关蛋白 (GGPP synthase-related protein) | 催化 | 推定的GGPP合酶相关蛋白，未进行酵母互补实验 |
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 反式聚异戊二烯橡胶合成 (trans-polyisoprene rubber biosynthesis) | Contig196, Contig1073, Contig2579, Contig2846, Contig4112, RB047_K12 | 橡胶颗粒膜蛋白/橡胶延伸因子/小橡胶颗粒蛋白 (RPMP/REF/SRPP) | 区室化 | 与巴西橡胶树REF和SRPP同源，可能构成橡胶颗粒膜结构并参与聚异戊二烯链延伸 |
| Eucommia ulmoides (杜仲) | 维管组织发育与橡胶积累 | Contig1288 (ZeHB3), Contig295 (APL), RT060_J18 (CNA/ATHB15), RT015_F10 (REV/IFL1), RT026_A22 (REV/IFL1), Contig3125 (NST1), Contig366 (NST1) | 转录因子 (HD-ZIP, G2-like, NAC家族) | 调控 | 参与筛管、木质部及纤维发育，可能影响杜仲橡胶合成组织（如乳汁管）的形成 |
关键发现
- 构建的EST文库共获得27,752条高质量EST，组装为10,520个unigenes（4,302个contigs和6,218个singletons），平均contig长度751.2 bp，singleton长度580.6 bp
- 7,869个（74.8%）unigenes与NCBI nr数据库有显著匹配，7,743个（73.6%）与TAIR数据库匹配
- 外层组织特异表达基因872个，内层组织特异表达基因782个。鉴定到大量表达的主要乳胶蛋白（MLP）同源基因（Contig274，OT库223条EST、IT库85条EST，共308条）和金属硫蛋白同源基因（Contig251，共360条EST）。分离到6种甲羟戊酸途径基因（EuACAT1/2、EuHMGS1/2、EuHMGR1/2、EuMVK1、EuMVD1、EuIDI1）和4种DXP合酶基因（EuDXS1-4）
- EuACAT1、EuACAT2、EuHMGS1、EuMVK1、EuMVD1、EuIDI1、EuTIDS2、EuTIDS4能分别互补对应的酿酒酵母突变体（erg10、erg12、erg13、erg20、mvd1、idi1），而EuHMGS2、EuTIDS1、EuTIDS3、EuTIDS5不能互补。qPCR结果表明EuTIDS4在所有检测组织中均有较高表达，EuTIDS1在成熟叶中高表达，EuTIDS5在成熟芽和未成熟叶中强表达，各EuTIDS基因表达模式差异明显。
研究结论
通过EST文库构建与分析，为杜仲反式聚异戊二烯橡胶生物合成研究提供了重要基因资源和表达信息。鉴定的多个甲羟戊酸途径基因和异戊烯基二磷酸合酶基因中，EuTIDS1、3、5因序列特征和功能互补实验被推测为长链trans-异戊二烯基二磷酸合酶候选，是深入研究反式聚异戊二烯橡胶合酶的关键切入点。