One amino acid substitution in phytoene desaturase makes Chlorella zofingiensis resistant to norflurazon and enhances the biosynthesis of astaxanthin
- 作者
- Jin Liu, Yujuan Zhong, Zheng Sun, Junchao Huang, Gerhard Sandmann, Feng Chen
- 杂志
- Planta（2010）
- DOI
- 10.1007/s00425-010-1132-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高Chlorella zofingiensis中虾青素的含量，克服其含量相对较低（约0.6%干重）而限制商业化应用的问题。
研究策略
通过化学诱变剂EMS处理结合除草剂norflurazon筛选抗性突变体，获得稳定高产虾青素的突变株E17，并对其PDS基因的突变、酶活性和转录水平进行表征。
核心内容
本研究通过EMS化学诱变结合除草剂norflurazon筛选，从Chlorella zofingiensis中获得一株稳定高产虾青素的抗性突变株E17。序列分析表明其PDS基因发生C-T点突变，导致八氢番茄红素脱氢酶第516位亮氨酸替换为苯丙氨酸（L516F）。该突变不仅赋予对norflurazon的抗性，还意外提升了PDS催化活性。体外酶活测定显示，突变型PDS对norflurazon的I50为2.242 μM，较野生型的0.072 μM提高31倍，比活性达0.0315 μg ζ-胡萝卜素/(mg蛋白·h)，比野生型高29%。在高光诱导24 h时，E17的虾青素含量达0.38 mg/g，比野生型高43.7%；在30 g/L葡萄糖诱导下第6天虾青素含量为0.85 mg/g，比野生型高36%。RT-PCR表明PDS转录水平无差异，而BKT和CHYB转录水平显著上调。该发现首次揭示PDS中L516F替换兼具抗除草剂和增强类胡萝卜素合成的双重功能，为绿藻虾青素遗传工程提供了显性选择标记。
创新点
首次发现PDS中L516F氨基酸替换（由点突变C-T引起）不仅赋予对norflurazon的抗性，还意外地提高了PDS的催化活性，从而增强类胡萝卜素（包括虾青素）的生物合成，这与以往已知的降低PDS活性的抗性突变不同。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Chlorella zofingiensis ATCC 30412 | 类胡萝卜素生物合成途径 | PDS | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | L516F突变（C-T）赋予norflurazon抗性，且比活性提高约29% |
| Chlorella zofingiensis ATCC 30412 | 虾青素合成途径 | BKT | β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | E17中转录水平高于野生型，尤其在HL或葡萄糖诱导条件下 |
| Chlorella zofingiensis ATCC 30412 | 虾青素合成途径 | CHYB | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | E17中转录水平高于野生型，与虾青素积累增加相关 |
| Escherichia coli JM109 | 异源表达体系 | PDS-L516F | 突变型八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 用于体外酶活测定，证实抗性和活性增强 |
关键发现
- 突变株E17在0.25 μM norflurazon下可正常生长并合成正常水平的类胡萝卜素，而野生型生长受严重抑制
- 在0.5 μM norflurazon下E17仍能合成显著量的类胡萝卜素。E17对norflurazon的I50相比WT在TC积累和虾青素形成上分别高22.7倍和25.9倍。在高光（HL）诱导24 h时，E17的TC和虾青素含量分别为2.96和0.38 mg/g，比WT高27.9%和43.7%
- NPQ值高33.3%。在30 g/L葡萄糖诱导下，第6天E17的TC和虾青素含量分别为2.50和0.85 mg/g，比WT高18%和36%。PDS基因存在C-T点突变导致L516F替换。体外酶活测定显示，PDS-L516F对norflurazon的I50为2.242 μM，野生型PDS为0.072 μM，抗性提高31倍
- PDS-L516F的比活性为0.0315 μg ζ-胡萝卜素/(mg蛋白·h)，比野生型PDS高29%，比PDS-L516R高50%。RT-PCR显示PDS转录水平在WT和E17间无差异，而BKT和CHYB的转录水平在E17中显著升高。
研究结论
Chlorella zofingiensis E17中PDS基因的一个点突变（L516F）既赋予对norflurazon的抗性，又通过提高PDS比活性并上调BKT和CHYB的转录水平，增强了总类胡萝卜素和虾青素的生物合成。该突变PDS可作为绿藻遗传工程中增强虾青素合成的显性选择标记。