De Novo Transcriptomic Analysis of an Oleaginous Microalga: Pathway Description and Gene Discovery for Production of Next-Generation Biofuels
- 作者
- LingLin Wan, Juan Han, Min Sang, AiFen Li, Hong Wu, ShunJi Yin, ChengWu Zhang
- 单位
- Institute of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou, People's Republic of China; State Key Laboratory of Coal-Based Low Carbon Energy, Xinao Scientific & Technological Developmental Co. Ltd., Langfang, People's Republic of China
- 杂志
- PLoS ONE（2012）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0035142
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏基因组序列的产油微藻Eustigmatos cf. polyphem的基因和代谢通路信息，限制了其作为生物燃料原料的遗传改良。
研究策略
利用Illumina双端测序对E. cf. polyphem进行de novo转录组测序与组装，通过BLAST、GO、KEGG等注释，重构碳水化合物、脂肪酸、三酰甘油和类胡萝卜素等与生物燃料生产相关的代谢通路。
研究路线图
核心内容
本研究对缺乏基因组信息的产油微藻Eustigmatos cf. polyphem进行了de novo转录组测序与分析，旨在揭示其与生物燃料生产相关的代谢通路。通过Illumina双端测序获得29,199,432条reads（共2.33 Gb），组装得到75,632条unigenes（平均长度503 bp，N50为663 bp），其中14,982条被注释为CDS，9,098条unigenes归属113条KEGG通路。基于注释结果，重构了脂肪酸、三酰甘油、类胡萝卜素合成及糖酵解等关键通路，识别了ACCase、DGAT、PSY等重要酶基因。关键发现包括：该藻不含淀粉合成基因，以chrysolaminarin为主要碳储存化合物（第3天占总碳水化合物的59.6%，占干重26.69%）；氮限制条件下生物量可达>9 g/L，油脂含量超过60%，β-胡萝卜素占生物量5%；EPA合成主要经由ω3途径。氮充足时总碳水化合物从18.7%升至42.31%干重，氮限制时从20.08%升至44.8%干重。该研究为E. cf. polyphem提供了首个转录组资源，重建了主要代谢通路，为通过代谢工程改良该藻以提高生物燃料产量奠定了分子基础。
创新点
首次对非模式产油微藻E. cf. polyphem进行de novo转录组分析；构建了主要生物燃料相关代谢通路；发现该藻不含淀粉合成基因，以chrysolaminarin为主要碳储存化合物；预测EPA合成主要通过ω3途径。
研究对象（40）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Eustigmatos cf. polyphem | 脂肪酸生物合成 | ACCase | 乙酰辅酶A羧化酶 | 催化 | EC 6.4.1.2，催化乙酰CoA转化为丙二酰CoA，脂肪酸合成限速步骤 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 脂肪酸生物合成 | MAT | 丙二酰CoA-ACP转酰基酶 | 催化 | EC 2.3.1.39，转移丙二酰基到ACP |
| Eustigmatos cf. polyphem | 脂肪酸生物合成 | KAS III | 3-酮脂酰ACP合酶III | 催化 | EC 2.3.1.180，催化起始缩合反应 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 脂肪酸生物合成 | KAS I | 3-酮脂酰ACP合酶I | 催化 | EC 2.3.1.41，催化链延长至C16 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 脂肪酸生物合成 | KAR | 3-酮脂酰ACP还原酶 | 催化 | EC 1.1.1.100，还原反应 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 脂肪酸生物合成 | HD | 3-羟脂酰ACP脱水酶 | 催化 | EC 4.2.1.-，脱水反应 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 脂肪酸生物合成 | EAR | 烯脂酰ACP还原酶 | 催化 | EC 1.3.1.9，还原反应 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 脂肪酸去饱和 | AAD | Δ9 酰基-ACP脱饱和酶 | 催化 | EC 1.14.19.2，引入第一个双键 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 脂肪酸去饱和 | OAT | 油酰-ACP硫酯酶 | 催化 | EC 3.1.2.14，水解ACP释放游离脂肪酸 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 脂肪酸去饱和 | Δ12D | Δ12(ω6)-脂肪酸脱饱和酶 | 催化 | EC 1.4.19.6，油酸→亚油酸 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 脂肪酸去饱和 | Δ15D | Δ15(ω3)-脂肪酸脱饱和酶 | 催化 | EC 1.4.19.-，亚油酸→α-亚麻酸 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 脂肪酸去饱和 | Δ5-D | Δ5-脂肪酸脱饱和酶 | 催化 | EC 1.14.99.-，参与EPA合成 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 脂肪酸去饱和 | Δ6-D | Δ6-脂肪酸脱饱和酶 | 催化 | EC 1.14.99.-，参与EPA合成 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 脂肪酸延长 | Δ6-E | Δ6-脂肪酸延长酶 | 催化 | EC 6.21.3.-，C18→C20延长 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 三酰甘油生物合成 | GK | 甘油激酶 | 催化 | EC 2.7.1.30，甘油→G-3-P |
| Eustigmatos cf. polyphem | 三酰甘油生物合成 | GPAT | 甘油-3-磷酸酰基转移酶 | 催化 | EC 2.3.1.15，催化第一步酰化 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 三酰甘油生物合成 | AGPAT | 溶血磷脂酸酰基转移酶 | 催化 | EC 2.3.1.51，催化第二步酰化 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 三酰甘油生物合成 | PP | 磷脂酸磷酸酶 | 催化 | EC 3.1.3.4，PA→DAG |
| Eustigmatos cf. polyphem | 三酰甘油生物合成 | DGAT | 二酰甘油酰基转移酶 | 催化 | EC 2.3.1.20，DAG→TAG，主要途径 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 三酰甘油生物合成 | PDAT | 磷脂:二酰甘油酰基转移酶 | 催化 | EC 2.3.1.158，acyl-CoA非依赖途径 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 碳水化合物代谢 | UGPase | UDP-葡萄糖焦磷酸化酶 | 催化 | EC 2.7.7.9，G-1-P→UDP-葡萄糖 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 碳水化合物代谢 | UDPG | β-1,3-葡聚糖糖基转移酶 | 催化 | EC 2.4.1.34，chrysolaminarin合酶 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 碳水化合物代谢 | exo-Glu | 外切-1,3-β-葡聚糖酶 | 催化 | EC 3.2.1.58，从非还原端水解chrysolaminarin |
| Eustigmatos cf. polyphem | 碳水化合物代谢 | endo-Glu | 内切-1,3-β-葡聚糖酶 | 催化 | EC 3.2.1.39，随机切开β-1,3键 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 碳水化合物代谢 | BGL | β-葡萄糖苷酶 | 催化 | EC 3.2.1.21，水解寡糖为葡萄糖 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 类胡萝卜素生物合成 | GGPS | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | EC 2.5.1.1/2.5.1.10/2.5.1.29，IPP→GGPP |
| Eustigmatos cf. polyphem | 类胡萝卜素生物合成 | PSY | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | EC 2.5.1.32，两分子GGPP→八氢番茄红素 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 类胡萝卜素生物合成 | PDS | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | EC 1.14.99.-，八氢番茄红素→ζ-胡萝卜素 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 类胡萝卜素生物合成 | ZDS | ζ-胡萝卜素脱氢酶 | 催化 | EC 1.14.99.30，ζ-胡萝卜素→番茄红素 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 类胡萝卜素生物合成 | CrtH | 类胡萝卜素异构酶 | 催化 | EC 5.-.-.-，顺反异构 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 类胡萝卜素生物合成 | CrtY | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | EC 1.14.-.-，番茄红素→β-胡萝卜素 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 类胡萝卜素生物合成 | CrtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | EC 1.14.13.-，β-胡萝卜素→玉米黄素 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 类胡萝卜素生物合成 | ABA1 | 玉米黄素环氧化物酶 | 催化 | EC 1.14.13.90，玉米黄素→紫黄素 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 类胡萝卜素生物合成 | VDE | 紫黄素脱环氧化物酶 | 催化 | EC 1.10.99.3，紫黄素→玉米黄素 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 类胡萝卜素生物合成 | NSY | 新黄素合酶 | 催化 | EC 5.3.99.9，紫黄素→新黄素 |
| Eustigmatos cf. polyphem | 糖酵解 | HK | 己糖激酶 | 催化 | EC 2.7.1.1，葡萄糖→G-6-P |
| Eustigmatos cf. polyphem | 糖酵解 | GCK | 葡萄糖激酶 | 催化 | EC 2.7.1.2，葡萄糖→G-6-P |
| Eustigmatos cf. polyphem | 糖酵解 | G6PI | 葡萄糖-6-磷酸异构酶 | 催化 | EC 5.3.1.9，G-6-P↔F-6-P |
| Eustigmatos cf. polyphem | 糖酵解 | PFK | 磷酸果糖激酶-6 | 催化 | EC 2.7.1.11，F-6-P→FBP |
| Eustigmatos cf. polyphem | 糖酵解 | FBA | 果糖-二磷酸醛缩酶 | 催化 | EC 4.1.2.13，FBP→DHAP+GA3P |
关键发现
- 测序获得29,199,432条reads，总计2.33 Gb
- 组装得到75,632条unigenes，平均长度503 bp，N50为663 bp。在氮限制条件下，E. cf. polyphem生物量可达>9 g/L，油脂含量超过60%，β-胡萝卜素占生物量5%。氮充足时总碳水化合物从18.7%升至第3天42.31% DW，氮限制时从20.08%升至44.8% DW
- 第3天chrysolaminarin占总碳水化合物的59.6%，占DW的26.69%。注释到14,982条CDS，其中9,098条unigenes归属113条KEGG通路。识别了脂肪酸合成、TAG合成、类胡萝卜素合成及糖酵解等途径的关键酶基因，如ACCase、DGAT、PSY等。
研究结论
本研究为产油微藻E. cf. polyphem提供了首个转录组资源，重建了碳水化合物、脂肪酸、TAG和类胡萝卜素合成与分解代谢通路，为通过代谢工程提高微藻生物燃料产量奠定了分子基础。