Biosynthetic routes of hydroxylated carotenoids (xanthophylls) in Marchantia polymorpha, and production of novel and rare xanthophylls through pathway engineering in Escherichia coli
- 作者
- Miho Takemura, Takashi Maoka, Norihiko Misawa
- 单位
- Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University, 1-308, Suematsu, Nonoichi, Ishikawa 921-8836, Japan; Research Institute for Production Development, Sakyo-Ku, Kyoto 606-0805, Japan
- 杂志
- Planta（2014）
- DOI
- 10.1007/s00425-014-2213-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解析地钱（Marchantia polymorpha）中类胡萝卜素羟化酶（BHY和CYP97家族）的功能与进化，并通过途径工程在大肠杆菌中生产稀有和新型叶黄素。
研究策略
从地钱中克隆候选羟化酶基因，分别在大肠杆菌工程菌株中异源表达，利用产β-胡萝卜素或α-胡萝卜素的工程菌株检测酶活性；组合表达地钱环化酶/羟化酶基因与细菌酮化酶基因crtW，生产稀有类胡萝卜素。
核心内容
该研究从地钱中克隆了类胡萝卜素羟化酶基因MpBHY、MpCYP97A、MpCYP97B和MpCYP97C，并在工程大肠杆菌中异源表达以解析其功能。结果显示，地钱雄性叶状体中主要类胡萝卜素为叶黄素（56.3%）和β-胡萝卜素（30.9%），MpBHY编码β-环3,3'-羟化酶，可依次将β-胡萝卜素转化为β-隐黄质和玉米黄质，同时也能羟化α-胡萝卜素的β-环；MpCYP97C则是特异性作用于玉米黄质的ε-环羟化酶，与MpBHY协同生成叶黄素；而MpCYP97A未检测到羟化活性。进一步将地钱环化酶/羟化酶基因与细菌酮化酶基因crtW组合表达，在大肠杆菌中成功生产了稀有α-海胆酮（8.4 μg/gFW）、新型化合物4-酮基玉米黄质（10.7 μg/gFW）以及虾青素（14.5 μg/gFW）和角黄素（10.1 μg/gFW）。该工作首次鉴定了地钱中类胡萝卜素羟化酶的催化功能，并通过途径工程证明，组合植物来源酶与细菌修饰酶可在微生物中合成自然界罕见甚至尚未发现的叶黄素类化合物，为稀有类胡萝卜素的微生物生产提供了可行策略。
创新点
首次鉴定地钱中的类胡萝卜素羟化酶基因功能；发现MpCYP97C是特异性作用于玉米黄质的ε-环羟化酶；证明MpBHY同时负责β-和α-胡萝卜素β-环羟化；通过组合途径工程首次在大肠杆菌中生产新型类胡萝卜素4-酮基玉米黄质和稀有α-海胆酮。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 | 类胡萝卜素生物合成 | MpBHY | β-胡萝卜素3,3'-羟化酶 | 催化 | 来自地钱，同时羟化β-和α-胡萝卜素的β环，参与玉米黄质和叶黄素合成。 |
| 大肠杆菌 | 类胡萝卜素生物合成 | MpCYP97C | 细胞色素P450 97C | 催化 | ε-环羟化酶，特异性羟化玉米黄质的ε环生成叶黄素。 |
| 大肠杆菌 | 类胡萝卜素生物合成 | MpCYP97A | 细胞色素P450 97A | 催化 | 在E.coli中未显示类胡萝卜素羟化活性。 |
| 大肠杆菌 | 类胡萝卜素生物合成 | MpCYP97B | 细胞色素P450 97B | 催化 | 无类胡萝卜素羟化活性。 |
| 大肠杆菌 | 类胡萝卜素生物合成 | MpLCYb | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | 来自地钱，催化番茄红素生成β-胡萝卜素。 |
| 大肠杆菌 | 类胡萝卜素生物合成 | MpLCYe | 番茄红素ε-环化酶 | 催化 | 来自地钱，参与α-胡萝卜素合成。 |
| 大肠杆菌 | 类胡萝卜素生物合成 | crtW | β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Brevundimonas sp. SD212，催化α-胡萝卜素和玉米黄质的4-酮化，产生α-海胆酮和4-酮基玉米黄质。 |
| 大肠杆菌 | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，参与类胡萝卜素前体合成。 |
| 大肠杆菌 | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，催化GGPP合成八氢番茄红素。 |
| 大肠杆菌 | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素。 |
| 大肠杆菌 | 类胡萝卜素生物合成 | crtY | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，催化番茄红素生成β-胡萝卜素。 |
| 大肠杆菌 | 类胡萝卜素生物合成 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 来自Haematococcus pluvialis，增强IPP异构化，提高类胡萝卜素产量。 |
关键发现
- 地钱雄性叶状体中主要类胡萝卜素为叶黄素（56.3%）和β-胡萝卜素（30.9%），另有α-胡萝卜素（1.6%）、玉米黄质（1.0%）、花药黄质（2.3%）、紫黄质（1.6%）和9'-顺式新黄质（2.7%）。MpBHY在大肠杆菌中可将β-胡萝卜素转化为玉米黄质（经β-隐黄质），并将γ-胡萝卜素转化为rubixanthin。MpCYP97A和MpCYP97C单独不能羟化β-胡萝卜素或α-胡萝卜素
- MpCYP97A无活性。MpBHY可将α-胡萝卜素的β-环羟化产生玉米黄质
- MpBHY与MpCYP97C共同作用产生叶黄素。重组大肠杆菌生产多种类胡萝卜素，其中α-海胆酮含量8.4 μg/gFW，4-酮基玉米黄质10.7 μg/gFW，虾青素14.5 μg/gFW，角黄素10.1 μg/gFW（Table 1）。4-酮基玉米黄质为新型化合物。
研究结论
地钱中MpBHY编码β-环3,3'-羟化酶，负责玉米黄质和叶黄素生物合成；MpCYP97C作为ε-环羟化酶（玉米黄质3'-羟化酶）产生叶黄素。MpCYP97A可能不参与类胡萝卜素生物合成。通过将地钱基因与细菌crtW组合，在大肠杆菌中成功生产了稀有和新型叶黄素（如α-海胆酮和4-酮基玉米黄质），表明途径工程可以生产自然界中罕见或尚未发现的类胡萝卜素。