Cloning of a sesquiterpene synthase from Lavandula x intermedia glandular trichomes
- 作者
- Lukman S. Sarker, Zerihun A. Demissie, Soheil S. Mahmoud
- 单位
- University of British Columbia Okanagan
- 杂志
- Planta（2013）
- DOI
- 10.1007/s00425-013-1937-6
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从Lavandula x intermedia腺毛中克隆并功能表征9-epi-caryophyllene合成酶，揭示其表达调控机制，以理解薰衣草精油中倍半萜的合成。
研究策略
基于腺毛cDNA文库EST筛选获得候选基因，通过大肠杆菌异源表达、Ni-NTA纯化、体外酶活测定和GC-MS鉴定产物，并利用微阵列和RT-PCR分析基因表达模式。
研究路线图
核心内容
研究人员从薰衣草杂交种腺毛cDNA文库中筛选候选EST，克隆到一个编码倍半萜合成酶的基因LiCPS。该基因开放阅读框长1617 bp，编码539个氨基酸，预测蛋白约60 kDa，与狭叶薰衣草的反式α-香柠檬烯合成酶氨基酸同一性超过77%。通过大肠杆菌异源表达、Ni-NTA纯化及体外酶活测定，发现重组LiCPS仅以法尼基焦磷酸（FPP）为底物生成单一产物9-epi-caryophyllene，也能以香叶基焦磷酸（GPP）为底物生成柠檬烯、侧柏烷、月桂烯和罗勒烯等多种单萜，但不能利用橙花基焦磷酸（NPP）。微阵列与RT-PCR分析显示，LiCPS转录本在花蕾至盛花期表达上调29倍，在腺毛中高度富集而叶片中未检出，且在杂交种中的表达水平比狭叶薰衣草高约15倍，比宽叶薰衣草低数倍。该酶定位于细胞质，由于腺毛中甲羟戊酸途径活性较低，细胞质内FPP供应受限，可能解释了薰衣草精油中石竹烯类含量偏低的现象。9-epi-caryophyllene可占某些精油成分高达8%，该研究首次揭示了这一关键合成酶的生化特征与表达调控规律。
创新点
首次报道Lavandula x intermedia的9-epi-caryophyllene合成酶基因，发现其可特异利用FPP生成9-epi-caryophyllene，也能以GPP为底物生成多种单萜，但不能利用NPP；并揭示其表达受发育和物种特异性调控。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta(DE3)plysS | 倍半萜生物合成 | LiCPS | 9-epi-caryophyllene synthase | 催化 | 重组蛋白在大肠杆菌中表达并经Ni-NTA纯化，催化FPP生成9-epi-caryophyllene，也能从GPP生成单萜，但不能利用NPP。 |
关键发现
- 9-epi-caryophyllene可占某些薰衣草精油高达8%
- LiCPS的ORF长1617bp，编码539个氨基酸，预测蛋白大小约60kDa
- 与L. angustifolia的trans-alpha-bergamotene synthase氨基酸同一性超过77%
- 在EST库中对应51条EST
- 重组蛋白以FPP为底物时只生成9-epi-caryophyllene，以GPP为底物时生成limonene、thujane、myrcene和ocimene，但不能利用NPP
- 微阵列显示LiCPS转录本在花蕾至盛花期表达上调29倍，在L. x intermedia中比L. angustifolia高约15倍，比L. latifolia低2.28倍（L. x intermedia）和9.7倍（L. angustifolia），在腺毛中高度富集，叶片中未检测到。
研究结论
成功克隆并功能表征了Lavandula x intermedia的9-epi-caryophyllene合成酶（LiCPS），该酶定位在细胞质，在花腺毛中特异性高表达，且表达受发育和物种差异调控。由于薰衣草腺毛中MVA途径活性低，细胞质内FPP含量受限，可能导致精油中石竹烯含量较低。