Regulation of β-phellandrene synthase gene expression, recombinant protein accumulation, and monoterpene hydrocarbons production in Synechocystis transformants
- 作者
- Cinzia Formighieri, Anastasios Melis
- 单位
- University of California, Berkeley
- 杂志
- Planta（2014）
- DOI
- 10.1007/s00425-014-2080-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
蓝藻Synechocystis中异源萜烯合酶（β-phellandrene合酶）表达量低，导致β-phellandrene产量受限，需要优化表达调控元件以增加重组蛋白积累和产物产量。
研究策略
比较不同启动子（内源psbA2、cpc启动子，异源Ptrc启动子）和翻译起始元件（T7基因10的5'UTR、RBS、下游盒）驱动PHLS表达，并在不同基因组位点（psbA2、cpc）进行同源重组，评估PHLS蛋白积累和β-phellandrene产量。
研究路线图
核心内容
本研究在蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803中系统比较了不同启动子与翻译起始元件组合对异源β-phellandrene合酶（PHLS）表达及单萜产量的影响。通过将内源psbA2启动子、cpc启动子及异源Ptrc启动子，分别与T7基因10的5’UTR、核糖体结合位点和下游盒等翻译增强元件组合，并在psbA2或cpc基因组位点进行同源重组整合。结果显示，ΔpsbA2-trc-T7gene10-PHLS和Δcpc-PHLS菌株中PHLS蛋白相对积累量达到ΔpsbA2-PHLS菌株的约4倍，β-phellandrene产量从约11 μg/g dcw大幅提升至约259 μg/g dcw，蛋白增加4倍伴随22倍的产量提升。进一步分析表明，Ptrc启动子结合T7g10翻译元件相比单独使用Ptrc可使蛋白积累提高60%、产量提高200-250%。该研究证实异源萜烯合酶蛋白积累是蓝藻单萜生物合成的关键限速步骤，通过优化表达调控元件可显著提升目标产物产量。
创新点
首次在Synechocystis中利用Ptrc启动子结合T7基因10翻译起始区驱动β-phellandrene合酶表达；利用cpc位点替换实现强表达；证实提高萜烯合酶蛋白水平可大幅提高单萜产量。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MEP途径（萜类生物合成） | PHLS（β-phellandrene synthase） | β-phellandrene synthase | 催化 | 来自薰衣草，密码子优化，催化GPP生成β-phellandrene |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | — | psbA2 | — | 调控 | 内源启动子驱动PHLS表达，替换psbA2基因 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | — | cpc operon | — | 调控 | cpc启动子驱动PHLS表达，删除藻胆体外周杆 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | — | T7 gene10 5'UTR/RBS/downstream box | — | 调控 | 来自噬菌体T7基因10的翻译起始元件，增强翻译效率 |
关键发现
PHLS蛋白相对积累量在ΔpsbA2-PHLS中为100%，在ΔpsbA2-trc-T7gene10-PHLS和Δcpc-PHLS中提高至约400%（4倍）。β-phellandrene产量在ΔpsbA2-PHLS中约11 μg/g dcw，在ΔpsbA2-trc-T7gene10-PHLS和Δcpc-PHLS中约259 μg/g dcw（50 μmol photons m-2 s-1），最高达约0.25 mg/g dcw。4倍蛋白增加伴随22倍产量增加。Ptrc+T7g10组合比Ptrc单独使蛋白积累提高60%，产量提高200-250%。Δcpc-PHLS在170 μmol photons m-2 s-1下产量降至79 μg/g dcw，因cpc启动子在高光下下调。
研究结论
在Synechocystis中，异源萜烯合酶的表达量和蛋白积累是限速步骤。通过使用强启动子（Ptrc、cpc）和优化翻译起始元件（T7g10 5'UTR/RBS/downstream box），可显著提高β-phellandrene合酶蛋白水平，进而大幅提高β-phellandrene产量。未来需进一步提高重组酶蛋白积累或前体供给以改善碳分配比率。