Expression of Trichoderma reesei β-Mannanase in Tobacco Chloroplasts and Its Utilization in Lignocellulosic Woody Biomass Hydrolysis
- 作者
- Pankaj Agrawal, Dheeraj Verma, Henry Daniell
- 单位
- Department of Molecular Biology and Microbiology, Burnett School of Biomedical Sciences, College of Medicine, University of Central Florida, Orlando, Florida, United States of America
- 杂志
- PLoS ONE（2011）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0029302
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
木质纤维素生物质水解需要高效且低成本的酶降解技术，但现有的酶 cocktail 中缺乏甘露聚糖酶，且其生产成本高，难以满足大规模应用。
研究策略
利用烟草叶绿体转化系统表达里氏木霉的 man1 基因（β-甘露聚糖酶），对获得的叶绿体来源甘露聚糖酶进行酶学表征，并直接以粗酶液形式加入酶 cocktail 中用于松木水解，评估其对水解效率的促进作用。
研究路线图
核心内容
该研究利用烟草叶绿体转化系统首次表达了里氏木霉来源的β-甘露聚糖酶（man1基因），并对其酶学性质及在木质纤维素水解中的应用进行了系统评估。叶绿体来源的甘露聚糖酶在pH 3.0至7.0和40至70°C范围内稳定，最适pH为5.0、最适温度为70°C，其活性比大肠杆菌表达系统高6至7倍。在成熟或老叶中表达量达25 U/g叶片鲜重，幼叶则为11 U/g。将该酶的粗提液直接加入酶cocktail中用于松木水解，可使释放的葡萄糖当量增加20%，且差异具有统计学意义。通过组合木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、纤维素酶及果胶酶处理后，松木水解率最终达到最高水平，甘露聚糖酶的添加使葡萄糖当量比不加时提高20%。每株烟草可收获2366单位酶，每英亩每年三茬可产5600万单位，成本约0.005美分/单位，比商业酶便宜约6000倍。该研究证实叶绿体来源的β-甘露聚糖酶是针叶木生物质水解cocktail中的关键组分，能够显著提高发酵糖释放效率，且生产成本极低，在生物燃料、造纸等工业领域具有广阔应用前景。
创新点
首次在植物中表达真菌 β-甘露聚糖酶；叶绿体来源的甘露聚糖酶具有更宽的温度和 pH 稳定性，活性比大肠杆菌表达系统高 6-7 倍；无需纯化即可直接用于酶 cocktail；加入甘露聚糖酶可使松木水解释放的葡萄糖当量增加 20%。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana tabacum var. Petite Havana（叶绿体） | 甘露聚糖降解 | man1 | β-甘露聚糖酶（endo-β-mannanase） | 催化 | 来自里氏木霉（Trichoderma reesei），含碳水化合物结合模块（CBM），在叶绿体中实现功能性表达 |
| Escherichia coli XL-10 gold | 甘露聚糖降解 | man1 | β-甘露聚糖酶（endo-β-mannanase） | 催化 | 作为对照表达系统，因缺乏二硫键形成能力，活性显著低于叶绿体表达 |
| Nicotiana tabacum var. Petite Havana（叶绿体） | 半纤维素降解 | xyn, axe | 木聚糖酶（xylanase）、乙酰木聚糖酯酶（acetyl xylan esterase） | 催化 | 来自里氏木霉，用于酶 cocktail |
| Nicotiana tabacum var. Petite Havana（叶绿体） | 纤维素降解 | celD, egl, celO, bgl | 内切葡聚糖酶（CelD, Eg1）、外切葡聚糖酶（CelO）、β-葡萄糖苷酶（Bgl） | 催化 | CelD/CelO 来自热纤梭菌（Clostridium thermocellum），Eg1/Bgl 来自里氏木霉 |
| Nicotiana tabacum var. Petite Havana（叶绿体） | 果胶降解 | pelA, pelB, pelD | 果胶酸裂解酶（pectate lyase） | 催化 | 来自腐皮镰孢（Fusarium solani） |
| Nicotiana tabacum var. Petite Havana（叶绿体） | 纤维素降解辅助 | swo | Swollenin | 调控 | 来自里氏木霉，非催化性辅助蛋白，可能通过破坏氢键提高纤维素可及性 |
关键发现
- 叶绿体来源的β-甘露聚糖酶表达量达 25 U/g 叶片鲜重（成熟或老叶），幼叶为 11 U/g（降低 44%）；酶在 pH
- 0-7.0 和 40-70°C 范围内稳定，最适 pH
- 0、最适温度 70°C；植物粗提物酶活性比 E.coli 表达高 6-7 倍；在酶 cocktail 中加入甘露聚糖酶使松木释放的葡萄糖当量增加 20%（统计显著：p=0.038 和 p=0.013）；单独甘露聚糖酶水解率为
- 4%，与木聚糖酶和乙酰木聚糖酯酶组合为
- 6%，加入纤维素酶等为
- 1%，再加入甘露聚糖酶为
- 1%，经果胶酶处理后加入甘露聚糖酶获得最大水解（比不加甘露聚糖酶的
- 6% 高 20% 葡萄糖当量）；每株烟草可收获 2366 单位甘露聚糖酶，每英亩每年（三茬）可产 5600 万单位，成本约
- 005 美分/单位，比商业酶便宜约 6000 倍。
研究结论
叶绿体来源的 β-甘露聚糖酶是木质纤维素（特别是针叶木）生物质水解酶 cocktail 中的关键组分，能显著提高发酵糖释放，且生产成本远低于商业化酶，在生物燃料、造纸、石油、制药、咖啡和洗涤剂工业中具有广阔应用前景。