Virus-induced gene silencing of the two squalene synthase isoforms of apple tree (Malus × domestica L.) negatively impacts phytosterol biosynthesis, plastid pigmentation and leaf growth
- 作者
- Sandra M. Navarro Gallón, Carolina Elejalde-Palmett, Dimitri Daudu, Franziska Liesecke, Frédéric Jullien, Nicolas Papon, Thomas Dugé de Bernonville, Vincent Courdavault, Arnaud Lanoue, Audrey Oudin, Gaëlle Glevarec, Olivier Pichon, Marc Clastre, Benoit St-Pierre, Lucia Atehortúa, Nobuyuki Yoshikawa, Nathalie Giglioli-Guivarc'h, Sébastien Besseau
- 单位
- EA2106 Biomolécules et Biotechnologies Végétales, Université François Rabelais de Tours, Tours, France; Laboratorio de Biotecnologia, Sede de Investigacion Universitaria, Universidad de Antioquia, Medellin, Colombia; EA3061 Laboratoire de Biotechnologies Végétales appliquées aux plantes aromatiques et médicinales, Université Jean Monnet de Saint Etienne, Saint Etienne, France; EA3142 Groupe d'Etude des Interactions Hôte-Pathogène, Université d'Angers, Angers, France; Plant Pathology Laboratory, Iwate University, Morioka, Japan
- 杂志
- Planta（2017）
- DOI
- 10.1007/s00425-017-2681-0
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
苹果树中鲨烯合酶（SQS）两个亚型的功能及其在植物甾醇和三萜生物合成中的调控作用尚不清楚，尤其缺乏针对SQS体内功能的遗传学证据。
研究策略
从苹果树基因组中鉴定两个SQS亚型（MdSQS1和MdSQS2），通过体外酶活测定和酵母互补试验验证其功能，利用亚细胞定位和表达谱分析（包括qPCR和RNA-seq共表达网络）推测其代谢分工，并采用苹果潜隐球形病毒（ALSV）介导的VIGS技术同时沉默两个SQS基因，分析代谢产物变化和叶片表型。
核心内容
该研究从苹果树基因组中鉴定出两个功能性鲨烯合酶亚型MdSQS1和MdSQS2，二者开放阅读框分别为1239和1233 bp，核苷酸一致性达96%，均定位于内质网并具有催化法尼基焦磷酸生成角鲨烯的体外活性。表达分析显示两基因存在组织分工：MdSQS1在根和花中占主导（分别占SQS转录本的70%和90%），MdSQS2在茎和叶中占优（70%和80%）；冷处理24小时可使SQS总转录本瞬时上升12倍，其中MdSQS1诱导约30倍。利用苹果潜隐球形病毒介导的VIGS技术同时沉默两个SQS基因后，叶片SQS表达下降42%，导致叶片呈镰刀形并白化，第四片真叶发育停滞；沉默叶片中菜油甾醇降至对照的37%，β-谷甾醇显著降低，而熊果酸含量不变，同时MdOSC1和MdOSC3表达上调8倍、α-法尼烯合酶上调2.5倍。结果表明MdSQS1和MdSQS2分别偏向三萜和甾醇合成，植物甾醇缺乏通过影响细胞分裂破坏质体色素和叶片发育，同时验证了ALSV-VIGS作为苹果树代谢功能研究工具的有效性。
创新点
首次在苹果树中鉴定并表征两个功能性鲨烯合酶亚型；首次利用ALSV-VIGS方法在苹果树中实现对代谢途径关键酶（SQS）的体内功能研究；发现SQS沉默导致植物甾醇减少并引起叶片白化和镰刀形发育异常，揭示了植物甾醇在质体色素和叶片发育中的重要作用；通过共表达分析提出MdSQS1优先参与三萜合成而MdSQS2可能参与多种代谢。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 苹果树 (Malus × domestica cv. Golden Delicious) | 三萜/植物甾醇生物合成 | MdSQS1 | 鲨烯合酶1 | 催化 | 经鉴定为功能性SQS亚型，定位于内质网；VIGS沉默同时靶向MdSQS1和MdSQS2。 |
| 苹果树 (Malus × domestica cv. Golden Delicious) | 三萜/植物甾醇生物合成 | MdSQS2 | 鲨烯合酶2 | 催化 | 第二个SQS亚型，与MdSQS1同源，差异表达提示可能参与不同代谢分支。 |
| 苹果树 (Malus × domestica cv. Golden Delicious) | 三萜生物合成 | MdOSC1 | α-淀粉合酶 (α-amyrin synthase) | 催化 | 在三萜合成下游环化2,3-氧化角鲨烯；SQS沉默后转录水平上调8倍。 |
| 苹果树 (Malus × domestica cv. Golden Delicious) | 三萜生物合成 | MdOSC3 | α-淀粉合酶 (α-amyrin synthase) | 催化 | 与MdOSC1类似，SQS沉默后显著上调。 |
| 苹果树 (Malus × domestica cv. Golden Delicious) | 倍半萜生物合成 | MdAFS | α-法尼烯合酶 | 催化 | SQS沉默叶片中α-法尼烯积累，MdAFS表达上调2.5倍。 |
| 苹果树 (Malus × domestica cv. Golden Delicious) | 倍半萜生物合成 | MdGDS | 大根香叶烯D合酶 | 催化 | SQS沉默后偶有检出大根香叶烯D，但表达水平无显著变化。 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae erg9突变株2C1) | 甾醇生物合成 | ScERG9 | 鲨烯合酶 | 催化 | 阳性对照，用于酵母互补和体外酶活测定；苹果树SQS无法互补酵母生长但体外有活性。 |
| 长春花 (Catharanthus roseus) 细胞 | 亚细胞定位研究 | MdSQS1, MdSQS2 (YFP融合) | 鲨烯合酶 | 区室化 | 瞬时表达显示YFP-MdSQS1/2与内质网CFP标记共定位，证明两亚型锚定于内质网。 |
关键发现
- MdSQS1和MdSQS2的ORF分别为1239和1233 bp，核苷酸一致性96%，蛋白一致性94.5%
- 两者均定位于内质网表面，且具有体外催化FPP生成角鲨烯的活性。器官表达显示MdSQS1在根和花中分别占SQS转录本的70%和90%，而MdSQS2在茎和叶中分别占70%和80%
- 冷处理24小时使SQS总转录本瞬时上升12倍，其中MdSQS1诱导约30倍、MdSQS2约5倍
- PEG-6000胁迫同样在48小时诱导12倍表达。ALSV-VIGS沉默SQS导致第三片真叶中SQS表达下降42%，叶片呈镰刀形、白化，且第四片叶发育完全停滞
- SQS沉默叶片中β-谷甾醇含量显著低于对照，菜油甾醇仅为对照的37%，α-法尼烯积累（对照中未检出），而熊果酸含量无显著变化
- MdOSC1和MdOSC3表达上调8倍，α-法尼烯合酶（MdAFS）上调2.5倍
- 鐮刀叶凹面栅栏细胞数量比凸面少3倍，但细胞表面积差异微弱（凹面略小，统计显著但幅度小）。
研究结论
苹果树含有两个功能性的鲨烯合酶亚型MdSQS1和MdSQS2，它们在组织和胁迫响应中表现出差异表达，可能分别偏向三萜和植物甾醇合成。SQS沉默通过VIGS有效降低植物甾醇含量而不影响三萜积累（由OSC上调补偿），植物甾醇缺乏导致质体色素脱失和叶片发育异常（细胞分裂受损）。该研究证实ALSV-VIGS是苹果树代谢功能研究的有效工具，并为植物甾醇在发育和叶绿体完整性中的功能提供了新证据。