Engineering modular diterpene biosynthetic pathways in Physcomitrella patens
- 作者
- Aparajita Banerjee, Jonathan A. Arnesen, Daniel Moser, Balindile B. Motsa, Sean R. Johnson, Bjoern Hamberger
- 单位
- Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, East Lansing, MI 48824, USA; Wisconsin Energy Institute, 1552 University Ave, Madison, WI 53726, USA; Institute of Biochemistry, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Universitätsstraße 1, 40225 Düsseldorf, Germany
- 杂志
- Planta（2018）
- DOI
- 10.1007/s00425-018-3053-0
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在小立碗藓中建立模块化的二萜生物合成途径，以异源表达现代陆生植物的二萜合酶组合，生产工业相关二萜类化合物，并探索新的基因组整合位点（逆转座子位点）以克服单一中性位点的限制。
研究策略
采用模块化线性DNA片段和体内同源重组组装，将class II和class I二萜合酶基因通过LP4-2A接头连接成模块，与启动子和终止子片段共转化，整合到Pp108中性位点或PpatensLTR2逆转座子位点，通过GC-MS检测二萜产物。
研究路线图
核心内容
该研究在小立碗藓中建立了一套基于PCR的模块化二萜生物合成组装系统，将class II和class I二萜合酶基因通过LP4-2A接头连接成双基因模块，与启动子和终止子片段共转化，通过体内同源重组整合到Pp108中性位点或PpatensLTR2逆转座子位点。在Pp108位点成功实现了三组不同合酶组合的稳定表达：CfTPS2/SsSCS模块积累包括13R-(+)-manoyl oxide和(+)-manool在内的多种产物，总二萜积累量达0.74 ng/mg鲜重；TwTPS21/EpTPS1模块单一积累13R-ent-manoyl oxide（0.13 ng/mg鲜重）；CfTPS1/SsSCS模块单一积累(+)-manool。这些产物与植物来源一致，证明了模块化策略的可行性。然而在PpatensLTR2位点，报告基因EYFP虽能以16.7%的效率正确组装且荧光强度高于Pp108位点，但两个二萜模块在筛选320个抗性克隆中均未获得正确组装，且检测到20 bp缺失的串联体形成。结果表明Pp108位点适合二萜途径工程化，而逆转座子位点存在位置效应和组装不完整问题，需优化策略后才能用于代谢工程。
创新点
开发了基于PCR的模块化组装系统，可灵活组合不同二萜合酶；首次探索了小立碗藓中PpatensLTR2逆转座子位点作为异源基因整合位点的可行性；在Pp108位点成功实现了三组不同二萜合酶模块的稳定表达与产物积累。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Physcomitrella patens (pBK3) | 二萜生物合成 | CfTPS2 | CfTPS2 | 催化 | class II 二萜合酶，来自Coleus forskohlii，催化形成柯巴基二磷酸中间体 |
| Physcomitrella patens (pBK3) | 二萜生物合成 | SsSCS | SsSCS | 催化 | class I 二萜合酶，来自Salvia sclarea，sclareol合酶 |
| Physcomitrella patens (pBK3) | 二萜生物合成 | TwTPS21 | TwTPS21 | 催化 | class II 二萜合酶，来自Tripterygium wilfordii |
| Physcomitrella patens (pBK3) | 二萜生物合成 | EpTPS1 | EpTPS1 | 催化 | class I 二萜合酶，来自Euphorbia peplus |
| Physcomitrella patens (pBK3) | 二萜生物合成 | CfTPS1 | CfTPS1 | 催化 | class II 二萜合酶，来自Coleus forskohlii |
| Physcomitrella patens (pBK3) | 二萜生物合成 | PpCPS/KS | PpCPS/KS | 催化 | 内源双功能二萜合酶，在pBK3中已敲除以消除内源二萜背景 |
关键发现
- 在Pp108位点，模块M1（CfTPS2/SsSCS）积累13R-(+)-manoyl oxide、13S-(+)-manoyl oxide、(+)-manool、(+)-abienol和(+)-sclareol多种产物；M2（TwTPS21/EpTPS1）单一积累13R-ent-manoyl oxide；M3（CfTPS1/SsSCS）单一积累(+)-manool。二萜积累量：M2为0.13±0.02 ng 13R-ent-manoyl oxide/mg鲜重，M1为0.74±0.14 ng总二萜/mg鲜重。Pp108位点的正确组装效率：M1 25%、M2
- 1%、M3 5%、EYFP
- 5%；PpatensLTR2位点EYFP组装效率16.7%，但M2和M3在筛选320个卡那霉素抗性克隆中未获得正确组装。PpatensLTR2/EYFP系F荧光显著强于Pp108/EYFP系R，系H荧光极弱，qPCR显示系H的EYFP基因剂量比系R低约10倍。检测到串联体形成（head-to-tail方向，20 bp缺失）。
研究结论
模块化组装策略可在小立碗藓Pp108位点成功工程化二萜生物合成途径，获得与植物来源一致的二萜产物；PpatensLTR2逆转座子位点可用于整合报告基因，但大片段二萜模块整合效率低，存在位置效应和组装不完整等问题，需优化实验策略后方可用于代谢工程。