Generation and physiological characterization of genome-edited Nicotiana benthamiana plants containing zeaxanthin as the only leaf xanthophyll
- 作者
- Maria Sulli, Luca Dall'Osto, Paola Ferrante, Zeno Guardini, Rodrigo Lionel Gomez, Paola Mini, Olivia Costantina Demurtas, Giuseppe Aprea, Alessandro Nicolia, Roberto Bassi, Giovanni Giuliano
- 单位
- Casaccia Research Centre, Biotechnology and Agro-Industry Division, Italian National Agency for New Technologies, Energy and Sustainable Development (ENEA); Biotechnology Department, University of Verona; Council for Agricultural Research and Economics, Research Centre for Vegetable and Ornamental Crops (CREA); Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario (UNR)
- 杂志
- Planta（2023）
- DOI
- 10.1007/s00425-023-04248-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
如何通过基因组编辑使本塞姆氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中所有叶黄素类被玉米黄质取代，并系统表征由此产生的光合生理效应。
研究策略
利用CRISPR-Cas9技术同时编辑两个同源的LCYe基因和两个同源的ZEP基因，先通过瞬时转化优化gRNA，再通过农杆菌介导的稳定共转化获得突变体，利用LC-MS直接筛选高玉米黄质（HZ）株系，并进行全基因组重测序和光合生理表征。
研究路线图
核心内容
本研究通过CRISPR-Cas9技术同时编辑本塞姆氏烟草中的两个LCYe基因和两个ZEP基因，使叶片中玉米黄质成为唯一的叶黄素类化合物。研究者先以瞬时转化优化gRNA，再经农杆菌介导的稳定共转化获得突变体，借助LC-MS筛选出高玉米黄质株系HZ-9和HZ-11，并通过全基因组重测序确认无脱靶突变且T2代已剔除Cas9转基因。两个株系的玉米黄质含量分别达到303.3和350.3 μg/g干重，而野生型中几乎不可检测；总类胡萝卜素降低11%至19%，脱落酸含量下降79%至89%。突变体叶绿素含量较野生型下降约44%，Chl a/b比值升至3.71至3.76，Fv/Fm由0.82降至0.76，LHCII三聚体丰度约减半，PSII/PSI比值增加约60%。在高光强下，突变体NPQ活性较野生型降低约50%，但PSII光抑制程度与野生型相当，表明玉米黄质即便在缺乏其他叶黄素及LHCII减少的情况下，仍能凭借自身抗氧化能力维持较强的光保护功能。该工作为理解类胡萝卜素在光合机构中的分工及抗逆机制提供了重要材料。
创新点
['同时编辑四个同源基因（两个LCYe和两个ZEP）实现玉米黄质作为唯一叶黄素', '建立瞬时与稳定组合基因组编辑方法，并结合LC-MS直接筛选突变体', '获得无Cas9转基因的T2代纯合突变体，且无脱靶突变', '揭示玉米黄质替代所有其他叶黄素对光合机构、NPQ及光保护能力的影响']
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 类胡萝卜素生物合成 | LCYe1, LCYe2 | Lycopene epsilon cyclase (LCYe) | 催化 | 催化番茄红素ε环化，编辑后使叶黄素(lutein)合成受阻 |
| Nicotiana benthamiana | 类胡萝卜素生物合成（含ABA前体） | ZEP1, ZEP2 | Zeaxanthin epoxidase (ZEP) | 催化 | 催化玉米黄质环化为紫黄质，编辑后阻断violaxanthin与ABA合成 |
关键发现
- HZ-9和HZ-11植株中玉米黄质含量分别达303.3和350.3 μg/g DW（WT中不可检测），总类胡萝卜素分别降低19%和11%
- ABA含量分别降低79%和89%
- 叶绿素含量较WT降低约44%，Chl a/b比值升至3.76和3.71（WT为3.42），Fv/Fm从0.82降至0.76
- LHCII三聚体丰度降低约50%，PSII/PSI比值增加约60%
- 在>300 μmol photons m^-2 s^-1光照下NPQ活性较WT降低约50%，但过量光下PSII光抑制程度与WT相当。
研究结论
同时编辑LCYe和ZEP基因可获得以玉米黄质为唯一叶黄素的N. benthamiana植物；这种植物虽然LHCII丰度和NPQ活性降低，但在过量光下仍保持与WT相当的光耐受性，表明玉米黄质本身具有强大的抗氧化和光保护作用。