Amorpha-4,11-diene synthase: cloning and functional expression of a key enzyme in the biosynthetic pathway of the novel antimalarial drug artemisinin
- 作者
- T. Eelco Wallaart, Harro J. Bouwmeester, Jacques Hille, Lucas Poppinga, Niels C. A. Maijers
- 单位
- GenoClipp biotechnology B.V., Meditech Center, L.J. Zielstraweg 1, 9713 GX Groningen, The Netherlands; Plant Research International, P.O. Box 16, 6700 AA Wageningen, The Netherlands; Department Molecular Biology of Plants, University of Groningen, Kerklaan 30, 9751 NN Haren, The Netherlands
- 杂志
- Planta（2001）
- DOI
- 10.1007/s004250000428
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
青蒿素含量低、价格昂贵，化学合成不经济，需要克隆并功能验证青蒿素生物合成关键酶紫穗槐二烯合成酶（amorpha-4,11-diene synthase）的基因，为通过代谢工程提高青蒿素产量提供途径。
研究策略
基于倍半萜合酶保守序列设计简并引物，以干旱和光胁迫处理后的青蒿cDNA为模板PCR扩增探针，筛选青蒿cDNA文库获得全长基因；将基因在大肠杆菌中异源表达并鉴定酶催化产物；再通过农杆菌介导转化烟草，检测转基因植株中紫穗槐二烯的积累。
研究路线图
核心内容
该研究从药用植物青蒿中克隆了青蒿素生物合成的关键酶——紫穗槐二烯合成酶基因。研究者基于倍半萜合酶保守序列设计简并引物，以干旱和光胁迫处理后的青蒿cDNA为模板扩增探针，筛选cDNA文库获得全长基因，其cDNA全长2076个核苷酸，编码546个氨基酸，预测分子量63.9 kDa。将该基因在大肠杆菌中异源表达，重组酶催化法尼基焦磷酸生成紫穗槐二烯，占总产物的89%，另有四种次要产物。进一步通过农杆菌介导将基因转化烟草，在转基因植株中检测到紫穗槐二烯积累，含量为0.2至1.7 ng/g鲜重，而对照未检出。该工作首次从青蒿中克隆并功能验证了这一关键酶，证明该酶在异源体系中具有催化活性，为后续通过代谢工程调控青蒿素生物合成、提高青蒿素产量奠定了重要基础。但转基因烟草中产物浓度较低，提示该酶可能作为限速步骤，仍需在青蒿中过表达以验证其对青蒿素产量的实际提升效果。
创新点
首次从青蒿中克隆并功能表达了紫穗槐二烯合成酶；利用胁迫处理特异性地诱导该基因转录，使PCR扩增有足够模板；在非产紫穗槐二烯的烟草中成功异源表达并检测到产物。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 倍半萜/青蒿素生物合成 | amorpha-4,11-diene synthase cDNA | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 重组酶在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，催化FDP环化生成紫穗槐二烯 |
| Nicotiana tabacum | 倍半萜/青蒿素生物合成 | amorpha-4,11-diene synthase cDNA | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 转化烟草后检测到紫穗槐二烯积累，含量0.2-1.7 ng/g鲜重 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | 内源amorpha-4,11-diene synthase基因 | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 从青蒿中克隆该基因，是青蒿素生物合成的关键酶 |
关键发现
- 获得的cDNA全长2076个核苷酸，编码546个氨基酸，预测分子量63.9 kDa，等电点5.66
- 与青蒿推测的倍半萜环化酶同源性最高（67%相似性，50%同一性）。在大肠杆菌中表达的重组酶催化FDP生成紫穗槐二烯（占总产物89%），另含四个次要产物共11%
- 转基因烟草中紫穗槐二烯含量为0.2-1.7 ng/g鲜重，对照未检出。
研究结论
成功克隆了紫穗槐二烯合成酶cDNA，并证明其在大肠杆菌和烟草中均能功能表达，该酶是青蒿素生物合成途径的关键酶，可能作为代谢工程调控的限速步骤。但转基因烟草中产物浓度较低，需在青蒿中过表达该基因以验证其是否能提高青蒿素产量。