Functional analysis of the carS gene of Fusarium fujikuroi
- 作者
- Roberto Rodriguez-Ortiz, M. Carmen Limón, Javier Avalos
- DOI
- 10.1007/s00438-013-0739-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定并解析Fusarium fujikuroi中carS基因的功能，阐明其作为类胡萝卜素生物合成负调控因子的分子机制，并探索其调控网络。
研究策略
通过突变体等位基因测序验证carS与类胡萝卜素高产表型的因果关系；利用基因互补（自身互补和异源互补）验证功能保守性；采用抑制差减杂交(SSH)和RAPD差异展示筛选受carS调控的基因，并通过RT-PCR进行验证。
核心内容
通过等位基因测序、基因互补、抑制差减杂交和RT-PCR等手段，本研究系统解析了藤仓镰刀菌中carS基因的功能。结果显示carS编码一个含547个氨基酸的RING-finger蛋白，与尖孢镰刀菌直系同源物一致性高达93%（DNA）和95%（蛋白）。在6个独立突变体中鉴定出不同等位基因突变（如Trp169→amber、Trp169→opal、Gly330→Asp等），互补实验回复了野生型表型，证实carS为类胡萝卜素生物合成的负调控因子。异源互补中，藤仓镰刀菌carS仅能部分恢复尖孢镰刀菌突变体，转化株黑暗中carRA和carB mRNA水平比野生型光照时高约10倍，但类胡萝卜素含量至少低5倍，揭示转录与产物积累的不一致性。SSH筛选获得155个上调EST（对应37个基因）和92个下调EST（对应29个基因），但RT-PCR验证显示多数候选基因在突变体中mRNA水平与野生型无显著差异。carS mRNA在光照1小时后升高约5倍。综合结果表明，carS的调控具有物种特异性，涉及转录及转录后多层次机制，可能由非编码RNA介导。该工作首次在藤仓镰刀菌中功能鉴定carS基因，为深入理解真菌类胡萝卜素合成的调控网络提供了基础。
创新点
首次在F. fujikuroi中功能鉴定carS基因；发现F. fujikuroi的carS在F. oxysporum中只能部分互补，揭示调控的物种特异性和转录/转录后多层次性；SSH筛选发现大量候选基因，但多数在转录水平无显著变化，提出非编码RNA介导的转录后调控假说。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Fusarium fujikuroi | 类胡萝卜素生物合成 | carS | CarS (RING finger蛋白) | 调控 | 负调控因子，突变导致类胡萝卜素过量积累 |
| Fusarium fujikuroi | 类胡萝卜素生物合成 | carRA | CarRA (双功能八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶) | 催化 | 催化GGPP缩合和环化 |
| Fusarium fujikuroi | 类胡萝卜素生物合成 | carB | CarB (八氢番茄红素脱氢酶) | 催化 | 催化脱氢反应 |
| Fusarium fujikuroi | 类胡萝卜素生物合成 | carT | CarT (胡萝卜素加氧酶) | 催化 | 催化氧化裂解 |
| Fusarium fujikuroi | 类胡萝卜素生物合成 | carD | CarD (醛脱氢酶) | 催化 | 催化末端氧化 |
| Fusarium fujikuroi | 类胡萝卜素生物合成 | carX | CarX (β-胡萝卜素加氧酶) | 催化 | 催化β-胡萝卜素裂解为视黄醛 |
| Fusarium fujikuroi | 类胡萝卜素生物合成 | carO | CarO (视蛋白样蛋白) | 调控 | 推定感光受体，参与光信号调控 |
| Fusarium fujikuroi | 类胡萝卜素生物合成 | opsA | OpsA (视蛋白) | 调控 | 另一推定感光受体 |
| Fusarium oxysporum | 类胡萝卜素生物合成 | carS | CarS (RING finger蛋白) | 调控 | 用于异源互补，证明部分功能保守 |
| Fusarium fujikuroi | 硫胺素合成 | FVEG_09077 | Sti35 (硫胺素噻唑合酶) | 催化 | SSH筛选候选基因，但转录水平无显著差异 |
| Fusarium fujikuroi | 氮代谢 | FVEG_03920 | 氨转运蛋白 | 转运 | SSH筛选候选基因 |
| Fusarium fujikuroi | 氮代谢 | FVEG_08384 | 甲酸/亚硝酸盐转运蛋白 | 转运 | SSH筛选候选基因 |
| Fusarium fujikuroi | 能量代谢 | FVEG_01210 | ATP合酶α亚基 | 能量供给 | SSH筛选候选基因 |
关键发现
carS基因编码547个氨基酸的RING-finger蛋白，与F. oxysporum直系同源物在DNA和蛋白水平分别有93%和95%的一致性。在6个独立carS突变体中鉴定到不同等位基因突变，如SG1(Trp169→amber)、SF4(Trp169→opal)、SG36(Gly330→Asp)等。carS互补SG39恢复野生型表型，证明其因果性。异源互补实验显示，F. fujikuroi carS可部分恢复F. oxysporum carS突变体，但转化株在黑暗中carRA和carB mRNA水平比野生型光照时高约10倍，而类胡萝卜素含量至少低5倍，表明转录与产物不一致。carS mRNA在光照1小时后升高约5倍，而carB和carRA升高更显著。SSH共获得155个上调EST（对应37个基因）和92个下调EST（对应29个基因），其中carRA、carB、carO出现富集，但RT-PCR验证显示大多数候选基因在carS突变体中的mRNA水平与野生型无显著差异甚至更低。
研究结论
carS基因是F. fujikuroi类胡萝卜素生物合成的关键负调控因子，其功能在物种间部分保守；调控机制复杂，涉及转录和转录后水平，可能通过非编码RNA介导，但具体机制仍需深入探究。