Cloning of the astaxanthin synthase gene from Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) and its assignment as a β-carotene 3-hydroxyalse/4-ketolase
- 作者
- Kazuyuki Ojima, Jürgen Breitenbach, Hans Visser, Yutaka Setoguchi, Kazuyuki Tabata, Tatsuo Hoshino, Johan van den Berg, Gerhard Sandmann
- 单位
- Department of Applied Microbiology, Nippon Roche Research Center, 247-8530 Kamakura, Kanagawa, Japan; J. W. Goethe Universität, Molecular Biosciences 213, P.O. Box 111932, 60054 Frankfurt, Germany; Section of Fungal Genomics, Wageningen University, Dreijenlaan 2, 6703 Wageningen, HA, The Netherlands; Tamagawa University Research Institute, 6-1-1 Tamagawa-Gakuen, Machida, Tokyo, Japan; Dyadic Nederland BV, Utrechtseweg 48, 3704 Zeist, HE, The Netherlands
- 杂志
- Molecular Genetics and Genomics（2006）
- DOI
- 10.1007/s00438-005-0072-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并鉴定来自Xanthophyllomyces dendrorhous的虾青素合酶基因，明确其在β-胡萝卜素转化为虾青素中的催化功能及反应顺序
研究策略
通过β-胡萝卜素积累突变体的遗传互补筛选克隆基因；通过异源表达（大肠杆菌和多形汉逊酵母）验证功能；通过表达外源羟化酶/酮化酶和抑制剂实验确定反应顺序
核心内容
该研究从法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）中克隆了虾青素合酶基因asy，并对其功能进行了系统鉴定。通过β-胡萝卜素积累突变体的遗传互补筛选，首次克隆了该担子菌酵母的asy基因，其cDNA开放阅读框长1674 bp，编码557个氨基酸的CYP3A家族细胞色素P450单加氧酶。研究发现突变株ATCC96815在第8内含子剪接序列存在单碱基突变（g→a），导致mRNA剪接异常和蛋白失活。异源表达实验表明，该酶在大肠杆菌中需添加血红素和δ-氨基乙酰丙酸才能将β-胡萝卜素转化为角黄素。通过抑制剂实验确定4-酮化先于3-羟化的反应顺序：使用0.1 mg/ml氨基苯并三唑处理后，虾青素含量从42.0%降至3.3%，β-胡萝卜素从14.0%增至45.4%，且无玉米黄素积累。该研究证明单个Asy酶即可催化β-胡萝卜素转化为虾青素的两步反应，与已知的酮化酶和羟化酶均不相关，为虾青素的异源生产提供了新的基因资源。
创新点
首次克隆了担子菌酵母Xanthophyllomyces dendrorhous的虾青素合酶（asy）基因，证明其编码一个多功能CYP3A家族细胞色素P450单加氧酶，同时催化4-酮化和3-羟化反应，并阐明了先酮化后羟化的反应顺序
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→虾青素） | asy | 虾青素合酶（CYP3A家族细胞色素P450单加氧酶） | 催化 | 同时催化4-酮化和3-羟化，反应顺序先酮化后羟化；基因长3166 bp，含17个内含子，cDNA长1674 bp |
| Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) | 类胡萝卜素生物合成 | asy（突变体ATCC96815） | 失活的虾青素合酶 | 催化 | 第8内含子剪接序列g→a突变导致mRNA剪接异常，蛋白失活，表现为β-胡萝卜素积累 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成（异源重组） | asy + P450还原酶（来自酿酒酵母） | 虾青素合酶 + NADPH-细胞色素P450还原酶 | 催化 | 在E. coli中同时表达asy和P450还原酶，并补充血红素前体，可将β-胡萝卜素转化为角黄素（转化率约1%） |
| Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) | 类胡萝卜素生物合成 | bkt（来自Haematococcus pluvialis） | β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 导入β-胡萝卜素突变株PR-1-104后仅产生酮化产物（如角黄素），不能合成虾青素，证明Asy不是单一酮化酶 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) | 类胡萝卜素生物合成 | crtZ（来自Erwinia uredovora） | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 导入PR-1-104后仅产生羟化产物（如玉米黄素），不能合成虾青素，证明Asy不是单一羟化酶 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) | 类胡萝卜素生物合成 | P450还原酶（来自Saccharomyces cerevisiae） | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 为Asy提供电子，支撑P450催化的氧化反应 |
关键发现
- 克隆的asy基因全长3166 bp，含17个内含子
- cDNA开放阅读框1674 bp，编码557个氨基酸，分子量62.63 kDa
- 突变株ATCC96815在第8内含子剪接序列存在单碱基突变（g→a），导致mRNA剪接异常，蛋白失活
- 在大肠杆菌中异源表达时需添加血红素和δ-氨基乙酰丙酸才能将β-胡萝卜素转化为角黄素，转化率约1%
- 用0.1 mg/ml氨基苯并三唑（ABT）抑制后，虾青素含量从42.0%降至3.3%，而β-胡萝卜素从14.0%增至45.4%，且无玉米黄素积累，表明4-酮化是第一步
- 总类胡萝卜素含量对照为234±17 μg/g干重，ABT处理为252±24 μg/g干重
研究结论
Xanthophyllomyces dendrorhous中单个基因产物Asy（一种CYP3A型细胞色素P450）即可催化β-胡萝卜素转化为虾青素，包括4-酮化和3-羟化两步，且4-酮化先于3-羟化。该酶与已知的酮化酶和羟化酶均不相关，为虾青素生产提供了新的基因资源