Enhancing Production of Bio-Isoprene Using Hybrid MVA Pathway and Isoprene Synthase in E. coli
- 作者
- Jianming Yang, Mo Xian, Sizheng Su, Guang Zhao, Qingjuan Nie, Xinglin Jiang, Yanning Zheng, Wei Liu
- 单位
- Biomaterials Center, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao, China; Department of Biochemistry, Beijing Risun Chemical Technologies Institute, China Risun Coal Chemicals Group Limited, Beijing, China; College English Office, Foreign Languages School, Qingdao Agricultural University, Qingdao, China
- 杂志
- PLoS ONE（2012）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0033509
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
解决MVA途径中上途径（乙酰-CoA到MVA）为限速步骤，导致异戊二烯产量低的问题
研究策略
通过模块化替换和点突变优化MVA途径：用粪肠球菌的mvaE和mvaS（或突变体）替代酿酒酵母的ERG10/ERG13/tHMGR作为上途径，并与酿酒酵母下途径（ERG12/ERG8/ERG19/IDI1）及杨树异戊二烯合酶组合，在E. coli中实现高效异戊二烯生产
研究路线图
核心内容
本研究针对大肠杆菌中异戊二烯生物合成产量低的问题，通过模块化替换和定点突变策略优化了甲羟戊酸（MVA）途径。研究人员将MVA途径上途径（乙酰-CoA到MVA）由酿酒酵母来源替换为粪肠球菌来源的mvaE和mvaS基因，并与酿酒酵母下途径及杨树异戊二烯合酶组合表达。结果显示，仅更换上途径来源即使MVA产量从0.026 mg/L提升至1.31 g/L，提高约50倍。进一步对mvaS引入A110G点突变，MVA产量增至3.1 g/L，为野生型的2.37倍。摇瓶条件下，优化菌株YJM21产异戊二烯760 mg/L，较对照提高1.5倍；在BL21 star(DE3)宿主中达1091 mg/L。最终工程菌YJM25经40小时补料分批发酵，异戊二烯产量达6.3 g/L，为当时报道最高水平的12倍，葡萄糖转化率7%，达到理论极限的28%。该研究证明，通过切换MVA途径限速步骤的酶来源并结合点突变，可显著解除代谢瓶颈，为异戊二烯的工业化生物合成奠定了基础。
创新点
1. 将MVA途径上途径由酿酒酵母替换为粪肠球菌，MVA产量提高约50倍；2. 对mvaS基因进行A110G定点突变，进一步提高MVA和异戊二烯产量；3. 获得异戊二烯产量达6.3 g/L的工程菌，为当时最高报道
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（上途径） | mvaE | 乙酰-CoA乙酰转移酶/HMG-CoA还原酶（双功能） | 催化 | 来自Enterococcus faecalis，替代酿酒酵母的ERG10和tHMGR |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（上途径） | mvaS | HMG-CoA合酶 | 催化 | 来自Enterococcus faecalis，野生型 |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（上途径） | mvaSM7 (A110G) | HMG-CoA合酶（突变体） | 催化 | A110G突变，使MVA产量提高2.37倍 |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（下途径） | ERG12 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自Saccharomyces cerevisiae |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（下途径） | ERG8 | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自Saccharomyces cerevisiae |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（下途径） | ERG19 | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 | 催化 | 来自Saccharomyces cerevisiae |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（下途径） | IDI1 | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 来自Saccharomyces cerevisiae，催化IPP与DMAPP互变 |
| E. coli BL21(DE3) | 异戊二烯合成 | ispS (ispSpa) | 异戊二烯合酶 | 催化 | 来自Populus alba，密码子优化用于E. coli |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（上途径，原始） | ERG10 | 乙酰乙酰-CoA硫解酶 | 催化 | 来自Saccharomyces cerevisiae，原菌株YJM13中使用，后被mvaE替代 |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（上途径，原始） | ERG13 | HMG-CoA合酶 | 催化 | 来自Saccharomyces cerevisiae，原菌株中使用 |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（上途径，原始） | tHMGR | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 来自Saccharomyces cerevisiae，原菌株中使用 |
关键发现
- 将MVA途径上途径来源从酿酒酵母改为粪肠球菌后，MVA产量从0.026 mg/L提高到1.31 g/L（约50倍）
- 对mvaS进行A110G突变后，MVA产量进一步提高至3.1 g/L（为野生型的2.37倍）
- 摇瓶条件下，表达优化上途径和异戊二烯合酶的菌株YJM21产生760 mg/L异戊二烯，比对照YJM20（500 mg/L）高1.5倍
- 在BL21 star(DE3)宿主中，YJM21产量达到1091 mg/L
- 外源添加10 mM甲羟戊酸时，下途径菌株最高产生213 mg/L异戊二烯
- 最终工程菌YJM25经40 h补料分批发酵，异戊二烯产量达6.3 g/L，为之前报道的12倍，葡萄糖转化率为7%，达到理论极限的28%
研究结论
本研究通过更换MVA途径上途径来源并引入mvaS A110G突变，优化了异戊二烯合成途径，在E. coli中实现了6.3 g/L的异戊二烯积累，证明该策略可显著提高异戊二烯产量，为工业化生产提供了基础