Nuclear factors GT-1 and 3AF1 interact with multiple sequences within the promoter of the Tdc gene from Madagascar periwinkle: GT-1 is involved in UV light-induced expression
- 作者
- P.B.F. Ouwerkerk, T.O. Trimborn, F. Hilliou, J. Memelink
- 杂志
- Molecular and General Genetics（1999）
- DOI
- 10.1007/s004380050003
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明长春花（Catharanthus roseus）Tdc基因启动子区（-572至-37）中核因子GT-1和3AF1的结合位点及其在UV光诱导表达中的作用，以及它们对基础表达和真菌诱导表达的影响。
研究策略
利用电泳迁移率变动分析（EMSA）和甲基化干扰实验鉴定Tdc启动子区与核因子GT-1和3AF1的结合位点；通过对GT-1结合位点进行定点突变，构建Tdc-gusA融合报告基因并转入烟草，分析突变对基础表达、真菌诱导表达和UV光诱导表达的影响。
核心内容
该研究以长春花Tdc基因启动子为对象，探究核因子GT-1和3AF1在该启动子多个区域的结合位点及其对表达调控的影响。通过电泳迁移率变动分析和甲基化干扰实验，鉴定出GT-1在-238至-99区域内的多个高亲和结合位点，其中对片段HD的亲和力最高，对TD和HT的亲和力分别约为其1/20和1/200；甲基化干扰识别出5个关键G残基，突变后GT-1结合被消除或显著降低。在转基因烟草中，突变GT-1结合位点不影响基础表达和真菌诱导表达（p值分别为0.796和0.203），但显著降低UV光诱导表达（p值为0.027），而4TD-37构建体使GUS活性提高超过13.6倍。该研究首次证明GT-1参与Tdc基因的UV光诱导表达，并提出了新的GT-1共识结合序列(G/A)NNN(G/A)GT(A/T)AA(A/T)(A/T)，表明GT-1可能作为多种防御基因的调控因子，其功能依赖于与其他因子的协同作用。
创新点
首次证明GT-1参与Tdc基因的UV光诱导表达；提出了新的GT-1共识结合序列(G/A)NNN(G/A)GT(A/T)AA(A/T)(A/T)，改进了原有共识序列；发现GT-1在Tdc启动子中与多个位点结合，且其功能可能依赖于与其他因子的相互作用。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱生物合成 | Tdc | 色氨酸脱羧酶（TDC） | 催化 | 催化色氨酸脱羧生成色胺，是TIA生物合成的关键步骤 |
| Nicotiana tabacum (转基因烟草) | Tdc基因表达调控 | Tdc | GT-1 | 调控 | GT-1与Tdc启动子多个区域结合，UV诱导表达中起重要作用 |
| — | Tdc基因表达调控 | 3AF1 | 3AF1 | 调控 | 核因子3AF1与Tdc启动子多个区域结合，具体功能未知 |
关键发现
- GT-1和3AF1在烟草和长春花核提取物中均与Tdc启动子-572至-37区域多个片段结合
- GT-1对片段HD（-238至-99）亲和力最高，对TD（-160至-99）和HT（-238至-160）的相对亲和力分别约为HD的1/20和1/200
- 甲基化干扰鉴定出5个关键G残基（-212、-209、-208、-158、-139），突变这些位点可消除或显著降低GT-1结合
- 在转基因烟草中，突变GT-1结合位点不影响基础表达（p值分别为0.796、0.203、0.260）和真菌诱导表达，但显著降低UV诱导表达（p值分别为0.089、0.123、0.027）
- 4TD-37构建体相比Δ37使GUS活性提高超过13.6倍。
研究结论
GT-1通过与Tdc启动子中多个位点结合，在UV光诱导的Tdc基因表达中发挥功能性作用，但不参与基础表达或真菌诱导表达；核因子3AF1也在多个区域结合，但其功能尚不明确；GT-1在植物中可能作为多种防御相关基因的调控因子，其具体作用依赖于与其他因子的相互作用。