A G-box element from the Catharanthus roseus strictosidine synthase (Str) gene promoter confers seed-specific expression in transgenic tobacco plants
- 作者
- P.B.F. Ouwerkerk, J. Memelink
- 杂志
- Molecular and General Genetics（1999）
- DOI
- 10.1007/s004380050006
- 所属领域
- 植物分子生物学
- 关键词
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解决的核心问题
研究长春花(Catharanthus roseus)中异胡豆苷合酶(Str)基因启动子中的G-box元件(CACGTG)是否具有调控作用及其在组织特异性表达中的功能。
研究策略
通过凝胶迁移实验(EMSA)验证Str G-box与烟草核因子及TAF-1的体外结合；构建野生型和突变型G-box四聚体与截短的CaMV 35S启动子(-47或-90)融合的gusA报告基因载体，转化烟草进行功能分析。
核心内容
该研究以长春花异胡豆苷合酶（Str）基因启动子中的G-box元件（CACGTG）为对象，探讨其在组织特异性表达中的调控功能。通过凝胶迁移实验证实Str G-box四聚体（4SW）能与烟草核因子形成A型迁移复合物，而核心序列突变的4SM则不能；重组转录因子TAF-1可结合单体SR，且4SW可竞争该结合。将四聚体与截短的CaMV 35S启动子（-47或-90）融合驱动gusA报告基因转化烟草后发现，4SW-47在叶片中无活性但能赋予种子特异性表达，且该表达依赖G-box核心序列完整性，突变体4SM-47完全丧失种子表达；4SW-90则在叶片中活性显著高于4SM-90。种子发育分析显示，4SW-47在授粉后15天才出现GUS染色，而4SW-90在5天即有表达并扩展至种荚组织。结合长春花中Str基因在发育种子中的表达，该研究表明G-box是功能性顺式元件，其四聚体能独立驱动种子特异性表达，侧翼序列影响组织特异性，且该元件不参与elicitor或UV响应。
创新点
发现Str G-box四聚体在仅含TATA box的启动子上能独立赋予发育调控的种子特异性表达，且该作用依赖于G-box核心序列的完整性；通过序列比较提出G-box侧翼核苷酸(-4,-3,-2及+4位)可能决定种子特异性。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana tabacum (烟草) | — | gusA | β-葡萄糖醛酸酶 | 催化 | 报告基因，用于检测启动子活性 |
| Catharanthus roseus (长春花) | 萜类吲哚生物碱生物合成 | Str | 异胡豆苷合酶 | 催化 | 催化色胺与裂环马钱子苷缩合形成异胡豆苷 |
| Nicotiana tabacum (烟草) | — | TAF-1 | TAF-1 | 调控 | 烟草G-box结合bZIP转录因子，体外可结合Str G-box |
| — | — | Str启动子G-box | — | 调控 | 顺式元件CACGTG，位于-108至-103，突变降低核因子结合及体内转录活性 |
关键发现
- EMSA显示烟草核提取物与Str G-box四聚体(4SW)形成A型迁移复合物，突变体4SM不能竞争
- 重组TAF-1可结合单体SR，4SW可竞争而4SM不能。转基因烟草中，4SW-90在叶片中表达活性明显高于4SM-90，而4SW-47在叶片中无活性，但在种子中检测到GUS活性
- 4SM-47无种子表达。种子发育分析表明4SW-47在授粉后5天和10天(DAF)无表达，至15 DAF才出现GUS染色，而4SW-90在5 DAF已有表达且扩展到种荚组织。Str基因在长春花发育种子(授粉后4周)中表达，mRNA水平与其他器官相当。
研究结论
Str基因启动子中的G-box是功能性顺式调控元件，其四聚体可独立于其他调控序列驱动种子特异性表达，并可通过与CaMV 35S -90至-47区域协同增强叶片表达。G-box侧翼序列影响其组织特异性功能，该元件不参与elicitor或UV响应。