In Vitro Assembly of Multiple DNA Fragments Using Successive Hybridization
- 作者
- Xinglin Jiang, Jianming Yang, Haibo Zhang, Huibin Zou, Cong Wang, Mo Xian
- 单位
- Biomaterials Center, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao, China
- 杂志
- PLoS ONE（2012）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0030267
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
传统多片段DNA组装方法依赖限制酶、连接酶或重组酶，缺乏序列无关性，且易受重复序列影响；需要开发一种简单、高效、序列无关且能容忍重复序列的体外组装方法。
研究策略
设计每个DNA片段（SF）的3'端一半与下一个SF的5'端一半重叠，通过高温变性-降温复性使各片段连续杂交，形成带缺口或空隙的环状重组DNA，转入细胞后由宿主修复。
研究路线图
核心内容
本研究开发了一种名为连续杂交组装（SHA）的体外多片段DNA组装方法，其核心策略是使每个DNA片段的3'端半段与下一个片段的5'端半段互补重叠，经高温变性后缓慢降温复性，各片段连续杂交形成带缺口或空隙的环状重组DNA，转化入宿主细胞后由胞内修复系统补齐缺口。该方法完全不依赖限制酶、连接酶或重组酶，具有序列无关性，并表现出对重复序列和较长缺口（如110 bp）的良好耐受性，且操作中无需DNA纯化与凝胶回收。实验结果显示，使用4、6、8个片段均可成功组装质粒，重叠长度低至50 bp即可生效，且效率随重叠长度增加而提高；在存在110、54、58、12 nt缺口时组装效率仍可保持76%。利用该方法构建了含4基因MVA途径的pTRICLow和含4基因丙酮途径的pAcetone，总测序长度51.9 kb中仅发现3个突变（2个来自引物、1个来自聚合酶）；相同条件下SLIC组装pAcetone的正确率仅为2/10，而SHA达到10/10。这表明SHA是一种稳健易用的多片段组装工具，尤其在处理含重复序列和多基因途径构建方面具有明显优势，为合成生物学提供了一种可靠的新手段。
创新点
1. 无需限制酶、DNA连接酶和重组酶；2. 序列无关；3. 对重复序列具有耐受性；4. 可容忍较长gap（如110 bp）；5. 操作简单，无需DNA纯化和凝胶回收。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 DH5α | 质粒复制/抗性 | cat | 氯霉素乙酰转移酶 | 催化 | 氯霉素抗性标记，用于pOKCA等质粒组装 |
| 大肠杆菌 DH5α | 质粒复制/抗性 | kan | 氨基糖苷磷酸转移酶 | 催化 | 卡那霉素抗性标记 |
| 大肠杆菌 DH5α | 质粒复制/抗性 | amp | β-内酰胺酶 | 催化 | 氨苄青霉素抗性标记 |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | MVA途径（异戊二烯生物合成） | ERG12 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，pTRICLow质粒组件 |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | MVA途径（异戊二烯生物合成） | ERG8 | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，pTRICLow质粒组件 |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | MVA途径（异戊二烯生物合成） | ERG19 | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，pTRICLow质粒组件 |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | MVA途径（异戊二烯生物合成） | IDI1 | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，pTRICLow质粒组件 |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | 丙酮生物合成途径 | thl | 硫解酶 | 催化 | 来自丙酮丁醇梭菌ATCC 824，pAcetone质粒组件 |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | 丙酮生物合成途径 | adc | 乙酰乙酸脱羧酶 | 催化 | 来自丙酮丁醇梭菌ATCC 824，pAcetone质粒组件 |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | 丙酮生物合成途径 | atoA | 乙酰乙酸辅酶A转移酶亚基A | 催化 | 来自大肠杆菌K12，pAcetone质粒组件 |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | 丙酮生物合成途径 | atoD | 乙酰乙酸辅酶A转移酶亚基D | 催化 | 来自大肠杆菌K12，pAcetone质粒组件 |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) | 异戊二烯生物合成 | ispS | 异戊二烯合酶 | 催化 | 来自银白杨的修饰基因，由pACY-IspS4编码，与pTRICLow共转化 |
| 枯草芽孢杆菌 | 无 | spaS | 枯草菌素启动子（调控元件） | 调控 | 来自pNZ8901，用于pJXL载体中控制eGFP表达 |
关键发现
- 成功用4、6、8个片段组装质粒，重叠长度可低至50 bp
- 组装效率随重叠长度增加而提高，无重叠则无组装
- 带gap（110、54、58、12 nt）时仍保持76%效率
- 构建了含4基因MVA途径的pTRICLow和含4基因丙酮途径的pAcetone
- 测序总长51.9 kb共发现3个突变（2个来自引物，1个来自聚合酶）
- 在相同条件下SLIC组装pAcetone仅2/10正确，而SHA为10/10正确。
研究结论
SHA是一种稳健、易用、可容忍重复序列的多片段DNA体外组装方法，有望成为合成生物学中的有力工具。