Simple, effective protein extraction method and proteomics analysis from polyunsaturated fatty acids-producing micro-organisms
- 作者
- Xueping Ling, Jing Guo, Chuqiang Zheng, Chiming Ye, Yinghua Lu, Xueshan Pan, Zhengqi Chen, I-Son Ng
- 单位
- Department of Chemical and Biochemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University; Fujian Key Laboratory of Advanced Materials, Xiamen University; Department of Chemical Engineering, National Cheng Kung University
- 杂志
- Bioprocess and Biosystems Engineering（2015）
- DOI
- 10.1007/s00449-015-1467-7
- 所属领域
- 蛋白质组学与代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
高脂质含量的多不饱和脂肪酸（PUFA）产生菌在蛋白质组学分析中，脂质会干扰蛋白质提取和电泳分离，缺乏简单有效的去除脂质并提取蛋白质的方法。
研究策略
比较冷休克、丙酮沉淀和乙醇沉淀三种去脂方法，结合三种细胞破碎方式（液氮研磨、均质机1次和2次循环），用于三种不同脂质含量的PUFA产生菌，通过SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS/MS评估蛋白质提取效果。
核心内容
针对多不饱和脂肪酸（PUFA）高产菌株蛋白质组学分析中脂质干扰蛋白提取与电泳分离的难题，本研究系统比较了冷休克、丙酮沉淀和乙醇沉淀三种去脂方法，并组合液氮研磨、均质机一次及两次循环三种细胞破碎方式，在三种脂质含量不同的PUFA产生菌中评估提取效果。结果显示，Schizochytrium sp. LU310脂质含量最高达60.3%（w/w），冷休克法在三种菌中均获得最高蛋白浓度和最佳SDS-PAGE分辨率，且无需昂贵试剂，操作简单经济；均质机15 kpsi两次循环破碎效果最佳。通过MALDI-TOF-MS/MS，在Schizochytrium中鉴定到2型脂肪酸合酶（蛋白得分117）、PUFA合酶亚基A和C及热休克蛋白90；在Mortierella alpina中鉴定到delta-5脂肪酸脱饱和酶、二酰甘油酰基转移酶；在Cunninghamella echinulata中鉴定到delta-6脱饱和酶等关键代谢蛋白。该冷休克法为高脂质含量产油微生物的蛋白质组学研究提供了简便有效的样品制备方案，有助于深入解析PUFA合成与调控机制。
创新点
首次提出冷休克（cold shock）法用于去除产油微生物蛋白质提取物中的脂质，无需昂贵试剂，简单经济且环境友好，可高效获得可用于电泳和质谱分析的高质量蛋白质样品。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Schizochytrium sp. LU310 | 脂肪酸生物合成 | — | Type I fatty acid synthase | 催化 | 蛋白得分117，上调表达，参与脂肪酸合成 |
| Schizochytrium sp. LU310 | 多不饱和脂肪酸合成 | — | Polyunsaturated fatty acid synthase subunit C | 催化 | 蛋白得分21，具有硝基烷单加氧酶和转移酶活性 |
| Schizochytrium sp. LU310 | 多不饱和脂肪酸合成 | — | Polyunsaturated fatty acid synthase subunit A | 催化 | 蛋白得分14，参与PUFA合成 |
| Schizochytrium sp. LU310 | 应激响应 | — | Heat shock protein 90 | 调控 | 蛋白得分77，高糖低氮条件下上调表达 |
| Mortierella alpina | 花生四烯酸生物合成 | — | Delta-5 fatty acid desaturase | 催化 | 蛋白得分18，参与ARA合成 |
| Mortierella alpina | 脂质代谢 | — | Diacylglycerol acyltransferase | 催化 | 蛋白得分18，参与甘油三酯合成 |
| Mortierella alpina | 核苷酸代谢 | — | Orotidine-5'-phosphate decarboxylase | 催化 | 蛋白得分13，参与嘧啶合成 |
| Mortierella alpina | 辅因子合成 | — | 6-pyruvoyl tetrahydroperin synthase | 催化 | 蛋白得分15，参与四氢生物蝶呤合成 |
| Cunninghamella echinulata | γ-亚麻酸生物合成 | — | Delta-6-desaturase | 催化 | 蛋白得分13，参与GLA合成关键酶 |
| Cunninghamella echinulata | 磷酸戊糖途径 | — | 6-phosphogluconate dehydrogenase | 催化 | 蛋白得分9，产生NADPH |
| Cunninghamella echinulata | 能量代谢 | — | Malic enzyme | 能量供给 | 蛋白得分13，催化苹果酸氧化脱羧产生NADPH |
| Cunninghamella echinulata | 脂质代谢 | — | NADPH-dependent cytochrome P450 oxidoreductase | 催化 | 蛋白得分13，参与氧化还原反应 |
关键发现
- Schizochytrium sp. LU310 生物量中脂质含量最高达
- 3%（w/w），DHA 最高占脂质 44%；Mortierella alpina 脂质含量最高
- 7%（w/w），ARA 最高占脂质
- 3%；Cunninghamella echinulata 脂质含量最高
- 8%（w/w），GLA 最高占脂质
- 3%。冷休克法在三种菌中均获得最高蛋白浓度和最佳电泳分辨率。均质机 15 kpsi 两次循环破碎细胞效果最佳。蛋白质组学鉴定到 Schizochytrium 中 2 型脂肪酸合酶（蛋白得分117）、PUFA合酶亚基A和C（得分14和21）、热休克蛋白90（得分77）；M. alpina 中鉴定到 delta-5 脂肪酸脱饱和酶、二酰甘油酰基转移酶等；C. echinulata 中鉴定到 delta-6 脱饱和酶、苹果酸酶等。
研究结论
冷休克法是一种简单有效的去除PUFA产生菌蛋白质粗提物中脂质的方法，适用于高脂质含量微生物的蛋白质组学研究，有助于理解产油微生物的代谢机制。