Acetolactate synthase (AlsS) in Bacillus licheniformis WX-02: enzymatic properties and efficient functions for acetoin/butanediol and L-valine biosynthesis
- 作者
- Yanli Huo, Yangyang Zhan, Qin Wang, Shunyi Li, Shihui Yang, Christopher T. Nomura, Changjun Wang, Shouwen Chen
- 单位
- Hubei Collaborative Innovation Center for Green Transformation of Bio-Resources, Environmental Microbial Technology Center of Hubei Province, College of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, People's Republic of China; School of Chemical and Biological Engineering, Lanzhou Jiaotong University, Lanzhou 730070, People's Republic of China; State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, People's Republic of China; Department of Chemistry, The State University of New York College of Environmental Science and Forestry (SUNY ESF), Syracuse, NY 13210, USA; Tobacco Research Institute of Hubei Province, Wuhan 430062, People's Republic of China
- 杂志
- Bioprocess and Biosystems Engineering（2017）
- DOI
- 10.1007/s00449-017-1847-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析地衣芽孢杆菌WX-02中乙酰乳酸合酶(AlsS)的酶学特性，并阐明其在乙偶姻/2,3-丁二醇和L-缬氨酸生物合成中的功能，以通过增强乙酰乳酸供应提高目标产物产量。
研究策略
通过在大肠杆菌中异源表达和纯化AlsS并进行酶学表征；利用基因敲除、互补和过表达策略构建重组地衣芽孢杆菌菌株，验证AlsS对产物合成的影响。
核心内容
该研究对地衣芽孢杆菌WX-02中乙酰乳酸合酶（AlsS）进行了异源表达、纯化及酶学表征，并系统验证了其在乙偶姻/2,3-丁二醇和L-缬氨酸生物合成中的作用。酶学分析显示，AlsS对丙酮酸的Km为3.96 mM，kcat为514/s，比活35.4 U/mg，最适pH 6.5、温度37°C，且受三种支链氨基酸反馈抑制，其中L-缬氨酸的抑制最强（Ki为2.73×10⁻³ mM）。基因敲除实验表明，alsS缺失菌株完全丧失乙偶姻/2,3-丁二醇和L-缬氨酸合成能力，互补菌株可部分恢复产量。过表达alsS的重组菌株WX-02/pT49alsRS使乙偶姻/2,3-丁二醇产量达57.06 g/L，较对照提高10.90%，L-缬氨酸产量达2.68 mM，提高92.80%。结果表明AlsS兼具分解代谢与合成代谢酶特性，是乙偶姻/2,3-丁二醇和L-缬氨酸合成途径的限速关键酶，过表达alsS可有效驱动碳代谢流向目标产物积累，为其他微生物中此类产物的代谢工程改造提供了可行策略。
创新点
首次深入表征地衣芽孢杆菌WX-02中AlsS的酶学性质，发现其同时具备分解代谢和合成代谢乙酰乳酸合酶的特性；证实过表达alsS可有效提升乙偶姻/2,3-丁二醇和L-缬氨酸的产量。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus licheniformis WX-02 | acetoin/2,3-butanediol和L-valine生物合成途径 | alsS | AlsS（乙酰乳酸合酶） | 催化 | 催化两分子丙酮酸生成α-乙酰乳酸，是乙偶姻/2,3-丁二醇和L-缬氨酸生物合成的关键酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达系统 | alsS | AlsS（乙酰乳酸合酶） | 催化 | 利用pET-28a(+)载体异源表达并纯化，用于酶学性质表征 |
| Bacillus licheniformis WX-02 | alsSD操纵子调控 | alsR | AlsR（转录调控因子） | 调控 | alsR为alsS的正调控基因，与alsS共表达构建过表达菌株 |
| Bacillus licheniformis WX-02 | acetoin/2,3-butanediol和L-valine生物合成途径 | alsS | AlsS（乙酰乳酸合酶） | 催化 | 基因敲除后菌株丧失产物合成能力，互补可部分恢复 |
关键发现
- AlsS对丙酮酸的Km为3.96 mM，kcat为514/s，比活为35.4 U/mg
- 最适pH 6.5，最适温度37°C
- 受L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸反馈抑制，Ki分别为2.73×10^-3 mM、1.19×10^-2 mM和0.19 mM。alsS缺失菌株完全不能产生乙偶姻/2,3-丁二醇和L-缬氨酸，互补菌株部分恢复（乙偶姻/2,3-丁二醇9.54 g/L，L-缬氨酸0.93 mM）。过表达alsS的菌株WX-02/pT49alsRS最高产量为乙偶姻/2,3-丁二醇57.06 g/L（较对照提高10.90%），L-缬氨酸2.68 mM（较对照提高92.80%）。
研究结论
地衣芽孢杆菌WX-02的AlsS是一种高效的乙酰乳酸合酶，同时具有分解代谢和合成代谢酶的特性，参与乙偶姻/2,3-丁二醇和L-缬氨酸的体内生物合成；过表达alsS是提高这些产物产量的有效策略，也可应用于其他微生物。