Establishment of Salvia castanea Diels f. tomentosa Stib. hairy root cultures and the promotion of tanshinone accumulation and gene expression with Ag+, methyl jasmonate, and yeast extract elicitation
- 作者
- Bo Li, Bangqing Wang, Hongyan Li, Liang Peng, Mei Ru, Zongsuo Liang, Xijun Yan, Yonghong Zhu
- 单位
- 西北农林科技大学 生命科学学院; 汉中植物研究所; 陕西中医药大学 药学院; 中国科学院 水土保持研究所; 浙江理工大学 生命科学学院; 天士力控股集团
- 杂志
- Protoplasma（2015）
- DOI
- 10.1007/s00709-015-0790-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
建立特有药用植物甘西鼠尾草（Salvia castanea Diels f. tomentosa Stib.）的毛状根培养体系，并通过不同诱导子（Ag+、茉莉酸甲酯和酵母提取物）促进丹参酮类活性成分的积累，为丹参酮的体外规模化生产提供有效方法。
研究策略
采用发根农杆菌ATCC 15834感染叶片外植体诱导毛状根，筛选高产毛状根系并优化培养基；在毛状根生长中期（18天）施加不同浓度的Ag+、MeJA和YE，分别考察其对生长量、丹参酮含量及相关生物合成基因表达的影响，并进行时间进程分析。
核心内容
利用发根农杆菌ATCC 15834感染甘西鼠尾草叶片外植体，首次建立了该特有药用植物的毛状根培养体系，转化频率为3.92%–8%。在毛状根生长中期分别施加Ag+（15 μM）、茉莉酸甲酯（200 μM）和酵母提取物（200 mg/L）三种诱导子，系统比较了其对丹参酮积累和相关基因表达的影响。结果显示，三种诱导子均能促进丹参酮合成，其中酵母提取物效果最佳：不仅使干重增加1.73倍，还将隐丹参酮含量提升至2.84 mg/g DW（为对照的8.37倍），丹参酮IIA提高2.77倍，并诱导二氢丹参酮从无到有积累（1.95 mg/g DW）。基因表达分析表明，酵母提取物在12小时使IPPI上调13.9倍，24小时使GGPPS上调16.7倍、HMGR上调5.6倍，Ag+和MeJA对相关基因也有不同程度的上调。该毛状根体系为丹参酮类活性成分的体外规模化生产提供了有效途径，同时揭示了不同诱导子调控丹参酮积累与生物合成基因表达之间的关联。
创新点
首次成功建立甘西鼠尾草毛状根培养体系；系统比较了Ag+、茉莉酸甲酯和酵母提取物三种诱导子对丹参酮积累和基因表达的影响；发现酵母提取物能大幅上调IPPI和GGPPS基因表达（分别达13.9倍和16.7倍），并显著促进二氢丹参酮和隐丹参酮的积累。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Salvia castanea Diels f. tomentosa Stib. hairy root（甘西鼠尾草毛状根） | 丹参酮生物合成（MVA/DXP途径） | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | MVA途径限速酶，受三种诱导子上调 |
| Salvia castanea Diels f. tomentosa Stib. hairy root（甘西鼠尾草毛状根） | 丹参酮生物合成（MVA/DXP途径） | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | DXP途径关键酶，受诱导子激活 |
| Salvia castanea Diels f. tomentosa Stib. hairy root（甘西鼠尾草毛状根） | 丹参酮生物合成（MVA/DXP途径） | IPPI | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 中间途径关键酶，酵母提取物处理12h上调13.9倍 |
| Salvia castanea Diels f. tomentosa Stib. hairy root（甘西鼠尾草毛状根） | 丹参酮生物合成（MVA/DXP途径） | GGPPS | 牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶 | 催化 | 二萜前体合成酶，酵母提取物处理24h上调16.7倍 |
关键发现
- 建立了甘西鼠尾草毛状根培养体系，转化频率为3.92%–8%
- 最佳诱导子浓度为15 μM Ag+、200 μM MeJA和200 mg/L YE。Ag+使丹参酮IIA含量提高1.8倍
- MeJA使丹参酮IIA含量提高1.99倍（最高1.8±0.11 mg/g DW）
- YE使干重增加1.73倍，隐丹参酮含量达2.84±0.33 mg/g DW（较对照提高8.37倍），丹参酮IIA提高2.77倍，并使二氢丹参酮从无到有（1.95±0.09 mg/g DW）。时间进程中，YE处理7天时隐丹参酮达3±0.08 mg/g DW（8.8倍），丹参酮IIA最高达2.52±0.67 mg/g DW。基因表达方面，YE在12h使IPPI表达上调13.9倍，在24h使GGPPS上调16.7倍、HMGR上调5.6倍
- DXR在4天上调5.9倍
- Ag+使HMGR、DXR、GGPPS最大分别上调3、2、4.6倍
- MeJA使HMGR、DXR、IPPI、GGPPS最大分别上调5.8、2.1、4.9、3.6倍。
研究结论
本研究首次建立了甘西鼠尾草毛状根培养体系，三种诱导子均能促进丹参酮积累和生物合成基因表达，其中酵母提取物效果最佳，可同步提高干重和多种丹参酮含量，并显著上调IPPI和GGPPS表达。该毛状根体系为丹参酮的体外生产提供了有效且便捷的途径，并揭示了诱导子调控丹参酮积累与基因表达之间的关系。