Identification and Characterization of a Novel Diterpene Gene Cluster in Aspergillus nidulans
- 作者
- Kirsi Bromann, Mervi Toivari, Kaarina Viljanen, Anu Vuoristo, Laura Ruohonen, Tiina Nakari-Setälä
- 单位
- Metabolic Engineering, VTT Technical Research Centre of Finland, Espoo, Finland; Technologies for Health Promoting Foods, VTT Technical Research Centre of Finland, Espoo, Finland; Metabolomics, VTT Technical Research Centre of Finland, Espoo, Finland; Business Solutions Management, VTT Technical Research Centre of Finland, Espoo, Finland
- 杂志
- PLoS ONE（2012）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0035450
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
真菌中许多次级代谢基因簇在实验室条件下沉默，产物未知。本文旨在通过基因组挖掘和过表达途径特异性转录因子来激活并鉴定构巢曲霉中的新型二萜基因簇及其产物。
研究策略
通过基因组挖掘预测二萜基因簇，鉴定出Zn(II)2Cys6型转录因子PbcR，在构巢曲霉FGSC A4中过表达pbcR，利用qPCR和DNA芯片分析基因簇边界和转录水平，再用SPME-GC/MS和GC/MS鉴定挥发性产物，并通过显微镜和孢子计数观察形态变化。
研究路线图
核心内容
该研究通过基因组挖掘在构巢曲霉FGSC A4中预测到一个沉默的二萜基因簇，并鉴定出其中的Zn(II)2Cys6型途径特异性转录因子PbcR。通过在野生型菌株中过表达pbcR，成功激活了该基因簇。qPCR和芯片分析显示，pbcR过表达使其转录水平提高79至109倍，并显著上调了七个相邻基因，包括GGPP合酶（AN1592.4，上调307,000倍）、HMG-CoA还原酶（AN1593.4，12,000倍）、双功能二萜合酶（AN1594.4，21,700倍）及细胞色素P450等。SPME-GC/MS和GC/MS分析鉴定出该基因簇的产物为ent-pimara-8(14),15-diene，其保留指数1943与文献值一致。这是构巢曲霉中首个被鉴定的二萜基因簇，且基因簇内包含HMG-CoA还原酶和GGPP合酶基因，此前未发现其参与萜类生物合成。此外，pbcR过表达使分生孢子数量减少约6倍，同时形成更多更大的闭囊壳，并导致青霉素等四个次级代谢基因簇下调。该工作证实了过表达途径特异性转录因子是激活沉默基因簇、发现新天然产物的有效策略。
创新点
首次在构巢曲霉中发现并激活二萜生物合成基因簇；鉴定出新的真菌海松二烯环化酶基因（AN1594.4）；发现基因簇内包含HMG-CoA还原酶和GGPP合酶基因，此前未参与构巢曲霉萜类生物合成；证实过表达途径特异性转录因子是激活沉默基因簇的有效策略。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus nidulans FGSC A4 | 二萜生物合成 (ent-pimara-8(14),15-diene) | pbcR (AN1599.4) | PbcR (Zn(II)2Cys6型转录因子) | 调控 | 途径特异性激活因子，过表达可激活整个二萜基因簇 |
| Aspergillus nidulans FGSC A4 | 二萜生物合成 (ent-pimara-8(14),15-diene) | AN1594.4 | ent-pimara-8(14),15-diene合酶（双功能二萜合酶） | 催化 | 含有A型(VYDTAW)和B型(DEFME)环化基序，催化GGPP经ent-copalyl二磷酸中间体转化为ent-pimara-8(14),15-diene |
| Aspergillus nidulans FGSC A4 | 甲羟戊酸途径 / 二萜前体供给 | AN1593.4 | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 基因簇内编码，可能专门为ent-pimara-8(14),15-diene生物合成提供异戊二烯前体 |
| Aspergillus nidulans FGSC A4 | 二萜前体供给 | AN1592.4 | GGPP合酶 | 催化 | 催化生成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP），为二萜合酶提供直接底物 |
| Aspergillus nidulans FGSC A4 | 二萜生物合成 (ent-pimara-8(14),15-diene) | AN1598.4 | 细胞色素P450 | 催化 | 可能参与二萜氧化修饰，但在本实验条件下未检测到氧化产物 |
| Aspergillus nidulans FGSC A4 | 二萜生物合成 (ent-pimara-8(14),15-diene) | AN1596.4 | 短链脱氢酶 | 催化 | 基因簇内基因，推测参与产物后修饰，具体功能未知 |
| Aspergillus nidulans FGSC A4 | 二萜生物合成 (ent-pimara-8(14),15-diene) | AN1597.4 | 假定甲基转移酶 | 催化 | 基因簇内基因，推测参与甲基化修饰，具体功能未知 |
| Aspergillus nidulans FGSC A4 | 推定的二萜基因簇（未激活） | AN3250.4 | 推定的Zn(II)2Cys6型转录因子 | 调控 | 过表达后（431-2680倍）未能激活其邻近的萜烯合酶和P450基因，可能需其他调控条件 |
关键发现
- 过表达pbcR使pbcR转录水平提高79-109倍（不同转化株），并使七种相邻基因显著上调：GGPP合酶AN1592.4（qPCR 307,000倍
- 芯片673倍）、HMG-CoA还原酶AN1593.4（12,000倍
- 439倍）、二萜合酶AN1594.4（21,700倍
- 785倍）、翻译延伸因子γ AN1595.4（19,000倍
- 513倍）、短链脱氢酶AN1596.4（420倍
- 41倍）、假定甲基转移酶AN1597.4（310倍
- 58倍）、细胞色素P450 AN1598.4（8,400倍
- 156倍）。产物经SPME-GC/MS和GC/MS鉴定为ent-pimara-8(14),15-diene（保留指数1943，与文献值1939-1963一致）。oe:PbcR中分生孢子数量比野生型减少6倍（平均3.9×10^5 vs 23.9×10^5），同时形成更多更大的闭囊壳。此外，过表达pbcR导致四个次级代谢基因簇（青霉素基因簇、两个聚酮合酶基因簇、一个非核糖体肽基因簇）下调，如acvA（AN2621.4）下调5.7倍、NRPS AN3495.4下调285倍。
研究结论
过表达途径特异性转录因子PbcR成功激活了构巢曲霉中原本沉默的二萜基因簇，导致ent-pimara-8(14),15-diene的产生。这是构巢曲霉中第一个被鉴定的二萜基因簇，包含新的海松二烯合酶、HMG-CoA还原酶和GGPP合酶。基因组挖掘结合转录因子过表达是发现新天然产物及其生物合成途径的有效方法。