The sub-cellular localisation of the potato (Solanum tuberosum L.) carotenoid biosynthetic enzymes, CrtRb2 and PSY2
- 作者
- Stefania Pasare, Kathryn Wright, Raymond Campbell, Wayne Morris, Laurence Ducreux, Sean Chapman, Peter Bramley, Paul Fraser, Alison Roberts, Mark Taylor
- 杂志
- Protoplasma（2013）
- DOI
- 10.1007/s00709-013-0521-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究马铃薯块茎中类胡萝卜素生物合成关键酶CrtRb2和PSY2的亚细胞定位，以理解调控类胡萝卜素在储藏器官中积累的因素。
研究策略
构建CrtRb2和PSY2与荧光蛋白（GFP/RFP）的融合蛋白，通过瞬时表达（本氏烟草和马铃薯叶片）和稳定转化（马铃薯块茎，B33块茎特异性启动子驱动）结合共聚焦显微镜观察亚细胞定位，并通过qRT-PCR和HPLC验证表达水平和类胡萝卜素含量。
核心内容
该研究以马铃薯块茎为对象，探究类胡萝卜素合成关键酶CrtRb2和PSY2的亚细胞定位特征。通过将两酶与GFP/RFP融合，在烟草和马铃薯叶片中进行瞬时表达，并利用B33块茎特异性启动子驱动在马铃薯中稳定转化，结合共聚焦显微镜观察定位，同时以qRT-PCR和HPLC检测表达与产物积累。结果显示，两酶在叶片和块茎中的定位模式截然相反：叶片中CrtRb2定位于叶绿体基质而PSY2呈浓缩斑点，块茎淀粉体中CrtRb2则分布于直径2–4微米的点状膜结构，PSY2反而呈基质分布。功能验证表明，稳定表达CrtRb2-RFP和PSY2-RFP的块茎总类胡萝卜素含量分别最高提升3.5倍和5倍，相应转录水平升高10倍和6倍。该发现首次揭示同一合成酶在不同组织中的亚细胞区室化差异，说明区室定位可能为类胡萝卜素积累提供额外调控层次，提示在改造储藏器官代谢时须针对目标组织验证酶的定位与功能。
创新点
首次揭示了马铃薯块茎淀粉体中CrtRb2和PSY2呈相反的亚细胞定位模式（CrtRb2位于点状膜结合结构，PSY2位于基质）；发现两酶在叶片和块茎中的定位模式相反；强调在目标组织中进行蛋白定位研究的重要性。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 马铃薯 (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) | 类胡萝卜素生物合成 | CrtRb2 | CrtRb2-RFP | 催化 | 在块茎淀粉体中定位于小囊泡/膜结合斑点结构，在叶片叶绿体中定位于基质 |
| 马铃薯 (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) | 类胡萝卜素生物合成 | PSY2 | PSY2-RFP | 催化 | 在块茎淀粉体中定位于基质，在叶片叶绿体中呈浓缩斑点 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 类胡萝卜素生物合成 | CrtRb2 | CrtRb2-GFP | 催化 | 瞬时表达于叶绿体基质，包括基质丝 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 类胡萝卜素生物合成 | PSY2 | PSY2-GFP | 催化 | 瞬时表达于叶绿体浓缩斑点，可能为质体小球 |
| 马铃薯 (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) | 类胡萝卜素生物合成 | CrtRb2 | CrtRb2-GFP | 催化 | 瞬时表达于马铃薯叶片叶绿体基质 |
| 马铃薯 (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) | 类胡萝卜素生物合成 | PSY2 | PSY2-GFP | 催化 | 瞬时表达于马铃薯叶片叶绿体浓缩斑点 |
关键发现
- 稳定表达CrtRb2-RFP和PSY2-RFP的马铃薯块茎总类胡萝卜素含量分别最高提升3.5倍和5倍
- 转基因系中CrtRb2转录水平升高10倍（K1系），PSY2转录水平升高6倍（R5系）
- 在叶片中CrtRb2定位于叶绿体基质，PSY2呈浓缩斑点
- 在块茎淀粉体中CrtRb2呈直径约2–4 μm的点状膜结合结构，PSY2呈基质分布。
研究结论
马铃薯类胡萝卜素合成酶CrtRb2和PSY2在不同组织（叶和块茎）中具有不同的亚细胞定位模式，表明亚细胞区室化可能为类胡萝卜素合成提供额外的调控层次，在代谢工程改造储藏器官时需考虑酶在目标组织中的定位。