Tryptophan over-producing cell suspensions of Catharanthus roseus (L) G. Don and their up-scaling in stirred tank bioreactor: detection of a phenolic compound with antioxidant potential
- 作者
- Priyanka Verma, Ajay K. Mathur, Nusrat Masood, Suaib Luqman, Karuna Shanker
- 单位
- Department of Plant Biotechnology, Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), Council of Scientific and Industrial Research, PO CIMAP, Kukrail Picnic Spot Road, Lucknow 226015, India; Molecular Bio-prospection Department, Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), Council of Scientific and Industrial Research, PO CIMAP, Lucknow 226015, India; Analytical Chemistry Division, Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), Council of Scientific and Industrial Research, PO CIMAP, Lucknow 226015, India
- 杂志
- Protoplasma（2012）
- DOI
- 10.1007/s00709-012-0423-5
- 所属领域
- 植物代谢工程/植物细胞工程
- 关键词
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解决的核心问题
长春花中色氨酸供应不足限制了萜类吲哚生物碱（TIAs）的合成，且缺乏适合生物反应器放大的细胞系；需要筛选色氨酸超产细胞系并优化放大工艺，同时探索副产物酚类化合物的利用价值。
研究策略
通过筛选5-甲基色氨酸（5-MT）抗性细胞系获得色氨酸反馈抑制放松的变异系，表征其生长、游离色氨酸及生物碱积累；选择优良N30系在7 L搅拌罐生物反应器中优化放大条件，并利用HPLC、NMR、ESI-MS及抗氧化活性检测发现酚类化合物。
核心内容
本研究以长春花细胞悬浮系为对象，针对色氨酸供应不足限制萜类吲哚生物碱（TIAs）积累及缺乏可放大细胞系的问题，利用5-甲基色氨酸（5-MT）筛选反馈抑制放松型抗性系，并考察其在7 L搅拌罐生物反应器中的放大表现。结果显示，5-MT抗性系游离色氨酸含量在无5-MT时为46.7至160.0 μg/g干重，添加5-MT后可升至168.0至468.0 μg/g干重，其中N30和P40系色氨酸分别达368.0和468.0 μg/g干重，总生物碱含量为0.65%至0.90%干重。N30系在3 L培养基、40 g接种量条件下培养8周，生物量增长18倍，添加30 mg/l 5-MT后收获时达30倍，总碱含量为0.26%至0.27%干重。此外，在生物反应器培养的粗碱提物中鉴定出一种酚类化合物（ESI-MS m/z=471），其总抗氧化能力、还原力、总酚含量及FRAP值分别比摇瓶培养物提高65.21%、17.75%、97.0%和100%，但DPPH清除活性反而降低57.47%。这些结果表明，5-MT抗性筛选可有效提升色氨酸与TIAs积累，N30系具备反应器放大潜力，且放大培养能诱导抗氧化酚类副产物生成，为长春花细胞培养的多目标价值开发提供了可行途径。
创新点
获得了耐受30-70 mg/l 5-MT的稳定细胞系，其中N30在生物反应器中添加5-MT使生物量达30倍；在粗碱提物中发现黄色结晶酚类化合物，并证明其具有强抗氧化活性。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus (L.) G. Don 细胞悬浮系（N30, P40, D40, D50, P70及其野生型） | 色氨酸生物合成/萜类吲哚生物碱（TIAs）合成 | anthranilate synthase (AS) | 邻氨基苯甲酸合酶（反馈抑制放松型） | 调控 | 5-MT抗性细胞系通过放松AS反馈抑制实现色氨酸超产，本文未进行基因操作，但讨论了该策略 |
| Catharanthus roseus N30细胞悬浮系 | 萜类吲哚生物碱合成 | tryptophan decarboxylase (TDC) | 色氨酸脱羧酶 | 催化 | 文中提到TDC是TIAs通路上游关键酶，虽然本文未改造，但色氨酸增加可能促进其底物供应 |
| Catharanthus roseus N30细胞悬浮系 | 莽草酸途径/酚类化合物合成 | — | — | 催化 | 生物反应器培养的N30细胞粗碱提物中检出酚类化合物（ESI-MS m/z=471），具有抗氧化活性 |
关键发现
- 5-MT抗性细胞系游离色氨酸在无5-MT时为46.7-160.0 μg/g干重，有5-MT时为168.0-468.0 μg/g干重
- N30和P40在5-MT存在下色氨酸高达368.0和468.0 μg/g干重，总生物碱含量达0.65-0.90%干重。N30在7 L搅拌罐反应器（Rushton桨、3 L培养基、40 g接种量、8周）中生物量达18倍，添加30 mg/l 5-MT一周后收获时达30倍，总碱含量0.26-0.27%干重。粗提物中酚类化合物（ESI-MS m/z=471）在50 μg/ml浓度下，总抗氧化能力、还原力、总酚含量和FRAP分别比摇瓶培养细胞提取物提高65.21%、17.75%、97.0%和100%，但DPPH自由基清除活性比摇瓶低57.47%。
研究结论
筛选5-MT抗性细胞系可有效提高长春花细胞中游离色氨酸水平，进而促进TIAs积累；N30系可在搅拌罐生物反应器中实现高效放大，且生物反应器培养能诱导酚类抗氧化化合物的积累，为长春花细胞培养的价值提升提供新途径。