高级醇 · 代谢工程文献库

← 返回列表

Molecular cloning and promoter analysis of squalene synthase and squalene epoxidase genes from Betula platyphylla

作者
Mengyan Zhang, Siyao Wang, Jing Yin, Chunxiao Li, Yaguang Zhan, Jialei Xiao, Tian Liang, Xin Li
单位
College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; State Key Laboratory of Tree Genetic Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; College of Life Science, Northeast Agriculture University, Harbin 150010, China
杂志
Protoplasma（2015）
DOI
10.1007/s00709-015-0893-3
所属领域
代谢工程
关键词
Betula platyphyllaBirch triterpenoidsPromoterSqualene epoxidaseSqualene synthase
阅读原文
查看 PDF 原文

解决的核心问题

从白桦中克隆三萜生物合成关键酶鲨烯合酶(SS)和鲨烯环氧化酶(SE)基因，并分析其启动子与表达调控机制，为通过代谢工程提高白桦三萜含量提供分子基础。

研究策略

采用简并PCR和RACE技术克隆BpSS和BpSE全长cDNA；利用生物信息学分析序列特征和系统进化；通过实时定量PCR检测组织特异性及外源激素（ABA、乙烯利、MeJA、SA）处理下的表达变化；使用Genome Walking法克隆启动子并预测顺式作用元件；借助农杆菌介导的洋葱表皮细胞瞬时表达分析BpSS亚细胞定位；构建酵母表达载体pYES2-BpSS和pYES2-BpSE，在INVScl1菌株中异源表达并通过HPLC和酶活测定验证功能。

研究路线图

100%
核心问题：白桦三萜合成关键酶基因（BpSS/BpSE）克隆与调控机制
结论：BpSS/BpSE为三萜合成关键限速酶，受激素调控，可作代谢工程靶点
Text is not SVG - cannot display

下载 .drawio 源文件

核心内容

该研究从白桦中克隆了三萜生物合成关键酶鲨烯合酶（BpSS）和鲨烯环氧化酶（BpSE）基因及其启动子。BpSS全长cDNA为1588 bp，编码413个氨基酸；BpSE全长2040 bp，编码526个氨基酸。表达分析显示两基因在叶片中表达量最高，根中最低；乙烯利处理6 h可使BpSS表达量增加80倍，BpSE在12–24 h上调，MeJA和ABA也有诱导作用。启动子克隆分别获得965 bp和1193 bp片段，包含ABRE、CGTCA-motif等激素和胁迫响应元件。亚细胞定位实验表明BpSS定位于细胞质。在酵母INVScl1菌株中异源表达后，诱导pYES2-BpSS的菌株角鲨烯含量达0.466 mg/g，为对照的13.2倍；诱导pYES2-BpSE的菌株角鲨烯环氧酶活性为2.131 pkat/g protein，为对照的11.84倍。结果证实BpSS和BpSE是三萜生物合成的关键限速酶且受多种激素调控，为通过代谢工程提高白桦三萜产量提供了基因资源和调控信息。

创新点

首次从白桦中克隆了鲨烯合酶(BpSS)和鲨烯环氧化酶(BpSE)基因及其启动子，并利用酵母异源表达和启动子分析验证了其参与三萜生物合成的功能，为桦木三萜的代谢工程改良提供了关键基因资源和调控信息。

研究对象（7）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Betula platyphylla 三萜生物合成（甲羟戊酸途径） BpSS 鲨烯合酶 (squalene synthase) 催化 催化两分子法尼基焦磷酸(FPP)缩合生成角鲨烯；含Trans_IPPS_HH和SQS_PSY保守结构域；定位于细胞质
Betula platyphylla 三萜生物合成（甲羟戊酸途径） BpSE 鲨烯环氧化酶 (squalene epoxidase) 催化 催化角鲨烯环氧化为2,3-环氧角鲨烯；含SDR超家族保守结构域
Saccharomyces cerevisiae INVScl1 三萜生物合成（甲羟戊酸途径） BpSS 鲨烯合酶 催化 异源表达后角鲨烯含量为0.466 mg/g，较空载体提高13.2倍
Saccharomyces cerevisiae INVScl1 三萜生物合成（甲羟戊酸途径） BpSE 鲨烯环氧化酶 催化 异源表达后酶活力为2.131 pkat/g protein，较空载体提高11.84倍
Betula platyphylla 三萜生物合成（甲羟戊酸途径） BpSS启动子 — 调控 克隆965 bp启动子，含ABRE、CGTCA-motif、GARE-motif、TGA element等激素响应元件
Betula platyphylla 三萜生物合成（甲羟戊酸途径） BpSE启动子 — 调控 克隆1193 bp启动子，含MBS、TC-rich repeats等胁迫响应元件
Allium cepa (onion epidermal cells) 三萜生物合成 BpSS 鲨烯合酶-GFP融合蛋白 区室化 瞬时表达显示BpSS定位于细胞质

关键发现

  1. BpSS全长cDNA为1588 bp（含poly-A尾），ORF 1241 bp，编码413个氨基酸
  2. BpSE全长cDNA为2040 bp，ORF 1581 bp，编码526个氨基酸。BpSS和BpSE在叶片中表达量最高，根中最低。乙烯利处理6 h后BpSS表达量增加80倍，BpSE在12-24 h上调
  3. MeJA处理24 h诱导二者表达
  4. ABA仅诱导BpSS
  5. SA对二者无显著影响。克隆到的BpSS启动子长965 bp，BpSE启动子长1193 bp，含TATA-box、CAAT-box以及ABRE、CGTCA-motif、GARE-motif、MBS等激素和胁迫响应元件。BpSS蛋白定位于细胞质。酵母中异源表达验证：诱导pYES2-BpSS的酵母角鲨烯含量为0.466 mg/g，是空载体对照（0.0338 mg/g）的13.2倍，是未诱导的（0.144 mg/g）的3.23倍
  6. 诱导pYES2-BpSE的酵母角鲨烯环氧酶活性为2.131 pkat/g protein，是空载体对照（0.1832 pkat/g protein）的11.84倍，未诱导的为0.2314 pkat/g protein。

研究结论

成功从白桦中克隆了BpSS和BpSE基因及其启动子，证实两者均参与三萜生物合成，且表达受多种植物激素调控。BpSS和BpSE在酵母中的异源表达显著提高了角鲨烯积累和环氧酶活性，表明它们是三萜生物合成的关键限速酶。该研究为通过代谢工程/基因工程手段调控白桦三萜产量提供了理论基础和基因资源。