Engineering overexpression of ORCA3 and strictosidine glucosidase in Catharanthus roseus hairy roots increases alkaloid production

作者: Jiayi Sun, Christie A. M. Peebles
单位: Colorado State University
杂志: Protoplasma（2016）
DOI: 10.1007/s00709-015-0881-7
所属领域: 代谢工程
关键词: Madagascar periwinklePlant secondary metabolismTerpenoid indole alkaloidTranscription factors
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解决的核心问题

长春花（Catharanthus roseus）毛状根中单独过表达正调控转录因子ORCA3不能显著提高萜类吲哚生物碱（TIA）总产量，原因是关键酶strictosidine glucosidase（SGD）被下调而成为限速步骤。

研究策略

利用糖皮质激素诱导型启动子在长春花毛状根中共表达ORCA3和SGD，协同激活TIA途径多个基因并补充不受ORCA3调控的限速酶，从而克服内源负调控并提高生物碱产量。

研究路线图

100%

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核心内容

该研究针对长春花毛状根中单独过表达转录因子ORCA3无法有效提升萜类吲哚生物碱（TIA）总产量的问题，提出将ORCA3与其不受调控且被其下调的关键酶strictosidine glucosidase（SGD）进行共表达的策略。研究者利用糖皮质激素诱导型启动子，在长春花毛状根中同时过表达ORCA3和SGD，以协同激活TIA途径多个基因并补充限速酶。经72小时诱导后，共表达系中serpentine、ajmalicine、catharanthine、tabersonine、lochnericine和hörhammericine分别增加44%、32%、38%、40%、60%和56%，总TIA生物碱池显著增加47%。RT-qPCR显示，共表达系中ORCA3 mRNA增加36.5倍、SGD mRNA增加10.2倍，同时G10H、TDC、DXS等途径基因被上调。结果表明，组合改造调控子和通路基因可突破单一转录因子工程瓶颈，为提升植物次生代谢产物产量提供了有效策略。

创新点

首次将正调控转录因子ORCA3与其不受其调控且被其下调的关键酶SGD进行共表达，证明组合改造调控子和通路基因可突破单一转录因子工程瓶颈，显著提高多种TIA类生物碱产量。

研究对象（3）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Catharanthus roseus hairy roots	Terpenoid indole alkaloid (TIA) pathway	ORCA3	ORCA3 (octadecanoid responsive Catharanthus AP2-domain protein)	调控	转录因子，正调控TIA途径多个基因，受茉莉酸诱导；在毛状根中通过糖皮质激素诱导型启动子过表达
Catharanthus roseus hairy roots	Terpenoid indole alkaloid (TIA) pathway	SGD	strictosidine glucosidase (strictosidine beta-glucosidase)	催化	催化strictosidine水解为strictosidine aglycone，是TIA下游分支的关键酶；ORCA3单独过表达时下调，共表达时显著提高
Catharanthus roseus hairy roots	Terpenoid indole alkaloid (TIA) pathway	G10H	geraniol 10-hydroxylase	催化	参与secologanin（TIA萜烯前体）合成；在ORCA3过表达系中上调3.7倍，共表达系上调2.1倍

关键发现

在ORCA3/SGD共表达毛状根系中，经72小时诱导后，serpentine增加44%、ajmalicine增加32%、catharanthine增加38%、tabersonine增加40%、lochnericine增加60%、hörhammericine增加56%，总TIA生物碱池显著增加47%（均p<0.05）。单独过表达ORCA3时，lochnericine增加56%但tabersonine下降97%，总TIA无显著变化。RT-qPCR显示ORCA3过表达使SGD转录下调至0.7±0.1倍，而共表达系中ORCA3 mRNA增加36.5±1.9倍、SGD mRNA增加10.2±1.2倍
同时TIA途径多个基因（G10H、TDC、DXS、SLS、LAMT、STR、T19H等）被上调，负调控因子ZCTs也被诱导表达。

研究结论

共表达ORCA3和SGD能够协同驱动代谢流向目标生物碱，显著提高长春花毛状根中TIA产量，优于单独过表达ORCA3，为通过组合调控子与通路基因提高植物次生代谢产物提供有效策略。