Molecular cloning and functional analysis of the phosphomannomutase (PMM) gene from Dendrobium officinale and evidence for the involvement of an abiotic stress response during germination
- 作者
- Chunmei He, Songjun Zeng, Jaime A. Teixeira da Silva, Zhenming Yu, Jianwen Tan, Jun Duan
- 单位
- Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China; P.O. Box 7, Miki-cho post office, Ikenobe 3011-2, Kagawa-ken, Takamatsu 761-0799, Japan
- 杂志
- Protoplasma（2017）
- DOI
- 10.1007/s00709-016-1044-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究铁皮石斛中磷酸甘露糖变位酶(PMM)基因的功能，特别是其与抗坏血酸(AsA)和多糖生物合成的关系，以及其在非生物胁迫（盐、干旱等）耐受性中的作用。
研究策略
从铁皮石斛中克隆DoPMM基因，进行亚细胞定位和组织表达分析；克隆启动子并分析顺式作用元件；用ABA、SA、冷、PEG和NaCl处理检测基因表达；在拟南芥中过表达DoPMM，测定AsA和多糖含量以及盐/甘露醇胁迫下的种子萌发率。
核心内容
该研究从铁皮石斛中克隆了磷酸甘露糖变位酶基因DoPMM，其cDNA全长1086 bp，开放阅读框759 bp，编码252个氨基酸，预测分子量28.618 kDa。亚细胞定位显示DoPMM蛋白定位于细胞质，组织表达分析表明其在茎中表达最高。启动子区域含有ABRE、TCA-element和MBS等与胁迫响应相关的顺式作用元件，ABA、SA、冷、PEG和NaCl处理均能显著上调该基因表达。在拟南芥中过表达DoPMM后，三个转基因株系的抗坏血酸含量较野生型（3.3 μmol/g FW）提高31%至40%，水溶性多糖含量较野生型（59 mg/g DW）提高22%至77%。在150 mM NaCl胁迫下，转基因株系种子萌发率（22%至36%）显著高于野生型（14%）；在300 mM甘露醇胁迫下，转基因株系萌发率（46%至56%）也明显高于野生型（31%）。这些结果证实DoPMM参与抗坏血酸和多糖生物合成，并在非生物胁迫条件下促进种子萌发，为利用该基因改良作物胁迫耐受性提供了遗传证据。
创新点
首次从铁皮石斛中克隆并功能验证了PMM基因，证明了DoPMM参与AsA和多糖生物合成，并提供了其调控非生物胁迫下种子萌发的遗传证据。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Dendrobium officinale | GDP-甘露糖合成通路 | DoPMM | PMM (磷酸甘露糖变位酶, EC 5.4.2.8) | 催化 | 基因来源；催化甘露糖-6-磷酸与甘露糖-1-磷酸的互变，为GDP-甘露糖合成提供前体；在茎中高表达，受ABA、SA、冷、PEG和NaCl诱导。 |
| Arabidopsis thaliana | 抗坏血酸生物合成及多糖合成 | DoPMM | PMM | 催化 | 异源过表达后，AsA和多糖含量显著增加，并提高盐和甘露醇胁迫下的种子萌发率。 |
| Arabidopsis thaliana | 抗坏血酸生物合成 | AtPMM (At2g45790) | PMM | 催化 | 内源PMM基因，在转基因株系中表达水平未受明显影响。 |
关键发现
- DoPMM cDNA全长1086 bp，ORF 759 bp，编码252个氨基酸（分子量28.618 kDa，pI 5.90）
- 与油棕等PMM蛋白有86%相似性
- 定位于细胞质
- 茎中表达最高
- 启动子含ABRE、TCA-element和MBS等胁迫相关顺式元件
- ABA、SA、冷、PEG和NaCl处理均显著上调其表达
- 35S::DoPMM转基因拟南芥#1、#2、#5中AsA含量分别比野生型增加40%、39%、31%（实际约4.7、4.6、4.4 μmol/g FW vs 野生型3.3 μmol/g FW），水溶性多糖含量分别增加77%、22%、39%（实际约104、72、82 mg/g DW vs 野生型59 mg/g DW）
- 在150 mM NaCl胁迫下，第三天转基因系#1、#2、#5的种子萌发率分别为36%、24%、22%，而野生型仅14%
- 在300 mM甘露醇胁迫下，分别为56%、50%、46%，而野生型仅31%。
研究结论
DoPMM基因参与铁皮石斛中AsA和多糖的生物合成，并在拟南芥中过表达后能提高盐和甘露醇胁迫下的种子萌发率，表明PMM基因在非生物胁迫耐受中起重要作用。