Scanning chimeragenesis: the approach used to change the substrate selectivity of fatty acid monooxygenase CYP102A1 to that of terpene ω-hydroxylase CYP4C7
- 作者
- Chiung-Kuang J. Chen, Robert E. Berry, Tatjana Kh. Shokhireva, Marat B. Murataleiv, Hongjung Zhang, F. Ann Walker
- 杂志
- Journal of Biological Inorganic Chemistry（2009）
- DOI
- 10.1007/s00775-009-0580-y
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过扫描嵌合方法改变细菌脂肪酸单加氧酶 CYP102A1 的底物选择性，使其像昆虫萜烯ω-羟化酶 CYP4C7 一样将法尼醇氧化为 12-羟基法尼醇。
研究策略
扫描嵌合（scanning chimeragenesis）：基于 CYP102A1 已知晶体结构与 CYP4C7 序列比对，将 CYP4C7 的同源肽段（SRS-1 的 78-82 和 F87，SRS-5 的 327-332 或 328-330）逐步替换入 CYP102A1，构建并筛选系列嵌合酶。
核心内容
该研究通过扫描嵌合方法改造细菌脂肪酸单加氧酶CYP102A1，使其底物选择性从脂肪酸转向昆虫萜烯ω-羟化酶CYP4C7的天然底物法尼醇。研究者基于CYP102A1已知晶体结构与CYP4C7的序列比对，将CYP4C7同源肽段逐步替换入CYP102A1的底物识别位点，构建系列嵌合酶并筛选催化活性。仅改变9个氨基酸即实现底物选择性转变，其中SRS-5区域328-330位APA→VPL突变是产生目标产物12-羟基法尼醇的关键。最佳嵌合酶C(78-82,F87L,328-330)对法尼醇的转换数为567 nmol min⁻¹ nmol⁻¹，约为野生型CYP102A1的2倍，比天然酶CYP4C7高约138倍，且12-羟基法尼醇为主产物；同时对月桂酸和棕榈酸的活性大幅下降至野生型的不足百分之一。该工作证明扫描嵌合是改变P450酶底物选择性和区域选择性的通用工具，仅需少量氨基酸替换即可实现功能重定向，为P450酶工程改造提供了新策略。
创新点
1. 发展了扫描嵌合方法，用未知结构的 P450 肽段替换已知结构 P450 的同源区域；2. 仅改变 9 个氨基酸（其中 8 个接触底物）即实现从脂肪酸到萜烯的底物选择性转变，并产生目标产物 12-羟基法尼醇；3. 发现 SRS-5 的 328-330 APA→VPL 突变是产生 12-羟基法尼醇的关键。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 脂肪酸ω-羟化 | CYP102A1 | CYP102A1 | 催化 | 野生型脂肪酸单加氧酶（细胞色素P450 BM3），催化脂肪酸及法尼醇氧化，法尼醇产物为2,3-环氧、10,11-环氧和9-羟基法尼醇 |
| Escherichia coli | 萜烯ω-羟化 | CYP4C7 | CYP4C7 | 催化 | 来自蟑螂（Diploptera punctata）的萜烯ω-羟化酶，以法尼醇为底物产生12-羟基法尼醇 |
| Escherichia coli | 法尼醇代谢 | CYP102A1突变体C(78-82,F87L,328-330) | 嵌合蛋白C(78-82,F87L,328-330) | 催化 | 最佳嵌合酶，法尼醇转换数567 ± 45，主要产物12-羟基法尼醇，对脂肪酸活性极低 |
关键发现
- 最佳嵌合酶 C(78-82,F87L,328-330) 对法尼醇的转换数为 567 ± 45 nmol min⁻¹ nmol⁻¹，约为野生型 CYP102A1（285 ± 22）的 2 倍，比 CYP4C7（4.1 ±
- 5）高约 138 倍。该酶产生 12-羟基法尼醇、15-羟基法尼醇和 10,11-环氧法尼醇的比例为
- 12:1.35:1，12-羟基法尼醇为主产物。C(78-82,F87L) 对法尼醇活性为 1700 ± 70，比野生型高约
- 7-6 倍，但不产生 12-羟基法尼醇。C(78-82,F87L,328-330) 对月桂酸和棕榈酸的转换数分别降至
- 7 ±
- 5 和
- 9 ±
- 1（野生型为 705 ± 35 和 2980 ± 140），底物选择性显著转向法尼醇。甲基法尼醇酸被代谢为 12-羟基甲基法尼醇酸（70%）和 10,11-环氧甲基法尼醇酸（30%），后者进一步生成 65% 12-羟基-10,11-环氧甲基法尼醇酸和 35% 15-羟基-10,11-环氧甲基法尼醇酸。所有嵌合蛋白 CO 差光谱 Soret 峰均在 450 nm，无 P420。
研究结论
扫描嵌合方法成功将 CYP102A1 改造为具有 CYP4C7 催化功能的酶，能高效将法尼醇羟基化为 12-羟基法尼醇，且对法尼醇活性约为 CYP4C7 的 100 倍以上、为野生型 CYP102A1 的约 2 倍，同时大幅降低对脂肪酸的活性。该方法可作为一种通用工具用于改变两个具有共同底物的 P450 之间的底物选择性和区域选择性。