Overexpression of tryptophan decarboxylase and strictosidine synthase enhanced terpenoid indole alkaloid pathway activity and antineoplastic vinblastine biosynthesis in Catharanthus roseus
- 作者
- Abhishek Sharma, Priyanka Verma, Archana Mathur, Ajay Kumar Mathur
- 单位
- Department of Plant Biotechnology, Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), Council of Scientific and Industrial Research, PO CIMAP, Kukrail Picnic Spot Road, Lucknow 226015, India; Division of Biochemical Sciences, National Chemical Laboratory (NCL), Council of Scientific and Industrial Research, Homi Bhabha Road, Pashan, Pune 411008, India
- 杂志
- Protoplasma（2018）
- DOI
- 10.1007/s00709-018-1233-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
长春花（Catharanthus roseus）中萜类吲哚生物碱（TIA）途径受到严格时空发育调控，细胞培养体系无法合成二聚体抗肿瘤生物碱长春碱和长春新碱，全植株水平遗传改造技术缺乏，导致这些高价值抗肿瘤药物分子产量低、无法满足市场需求。
研究策略
在整株水平上通过农杆菌介导的遗传转化（SAAT法）同时过表达TIA上游途径基因色氨酸脱羧酶（CrTDC）和异胡豆苷合酶（CrSTR），增强代谢流向目标产物长春碱的方向。
研究路线图
核心内容
本研究在长春花整株水平上，采用超声辅助农杆菌介导的遗传转化（SAAT）方法，同时过表达萜类吲哚生物碱（TIA）途径上游关键基因色氨酸脱羧酶（CrTDC）和异胡豆苷合酶（CrSTR），旨在克服细胞培养体系无法合成二聚体抗肿瘤生物碱的瓶颈。结果显示，最佳转基因株系AS3中总生物碱含量较对照提高2倍（1.9%对1.0%干重），文多灵和长春质碱含量最高提升9倍（分别达0.47%和0.26%干重），目标产物长春碱含量最高提高5倍（0.014%对0.003%干重）。分子水平检测表明，CrTDC和CrSTR转录水平最高分别增加38倍和65倍，并协同拉动下游途径基因CrSGD、CrD4H、CrDAT和CrPRX1表达上调21倍、9倍、7倍和7倍以上，同时色胺积累至280.9 μg/g干重（对照64.4 μg/g），而色氨酸含量相应降低。该工作首次在全植株再生体系中证实上游基因过表达可有效拉动下游代谢流，为长春花整株代谢工程改造及TIA途径调控机制研究提供了可行策略。
创新点
首次在长春花全植株水平上实现直接再生并同时过表达CrTDC和CrSTR基因；利用超声辅助农杆菌转化（SAAT）优化了长春花遗传转化体系，克服其再生困难；在完整植株中证实上游基因过表达可推动下游途径基因（如CrSGD、CrD4H、CrDAT、CrPRX1）表达协同上调，最终显著提高长春碱等二聚体生物碱产量。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus cv. Dhawal（长春花） | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成途径 | CrTDC | 色氨酸脱羧酶 | 催化 | 催化色氨酸转化为色胺，TIA途径上游关键酶 |
| Catharanthus roseus cv. Dhawal | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成途径 | CrSTR | 异胡豆苷合酶 | 催化 | 催化色胺和裂环马钱子苷缩合形成异胡豆苷，TIA途径进入次生代谢的关键步骤 |
| Catharanthus roseus cv. Dhawal | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成途径 | CrSGD | 异胡豆苷β-D-葡萄糖苷酶 | 催化 | 将异胡豆苷转化为活性次苷元，下游多个TIA分支共用的关键酶 |
| Catharanthus roseus cv. Dhawal | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成途径（文多灵分支） | CrT3O | 他波宁3-加氧酶 | 催化 | 参与他波宁向文多灵转化的羟基化步骤 |
| Catharanthus roseus cv. Dhawal | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成途径（文多灵分支） | CrT3R | 他波宁3-还原酶 | 催化 | 参与文多灵生物合成中的还原步骤 |
| Catharanthus roseus cv. Dhawal | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成途径（文多灵分支） | CrDAT | 脱乙酰文多灵4-O-乙酰转移酶 | 催化 | 文多灵生物合成最后步骤之一 |
| Catharanthus roseus cv. Dhawal | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成途径（文多灵分支） | CrD4H | 脱乙酰氧基文多灵4-羟化酶 | 催化 | 文多灵生物合成中催化羟基化反应 |
| Catharanthus roseus cv. Dhawal | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成途径（二聚体形成） | CrPRX1 | 过氧化物酶（α-3',4'-脱水长春碱合酶） | 催化 | 催化文多灵与长春质碱偶联形成α-3',4'-脱水长春碱，进而合成长春碱 |
| 农杆菌 Agrobacterium tumefaciens LBA1119 | 遗传转化载体系统 | hptII, uidA (gusA) | 潮霉素磷酸转移酶、β-葡萄糖醛酸酶 | 调控 | hptII为植物筛选标记，gusA为报告基因（含内含子） |
关键发现
- 获得的转基因株系中，最佳株系AS3总生物碱含量较对照提高2倍（1.9% vs
- 0% dry wt）；文多灵和长春质碱含量最高提高9倍（文多灵0.47% vs
- 04%，长春质碱0.26% vs
- 03%）；长春碱含量最高提高5倍（0.014% vs
- 003% dry wt）；色胺含量最高达280.9 μg/g dry wt（对照64.4 μg/g dry wt），而色氨酸含量降低至413.2-462.4 μg/g dry wt（对照480.1 μg/g dry wt）；CrTDC和CrSTR转录水平最高分别增加38倍和65倍，CrSGD最高增加21倍，CrD4H增加9倍，CrDAT增加7倍，CrPRX1增加7倍以上。
研究结论
在长春花整株水平上过表达CrTDC和CrSTR可以显著增强萜类吲哚生物碱途径的代谢流，促进单体生物碱文多灵和长春质碱的积累并可拉动下游途径基因表达上调，最终实现二聚体抗肿瘤生物碱长春碱产量的提升。该策略为长春花全植株代谢工程改造提供了可行方法，也为研究TIA途径基因对全株分化水平下生物碱合成的调控机制奠定了基础。