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Gene replacement of adenylate kinase in the gram-positive thermophile Geobacillus stearothermophilus disrupts adenine nucleotide homeostasis and reduces cell viability

作者
Rafael Couñago, Yousif Shamoö
杂志
Extremophiles（2005）
DOI
10.1007/s00792-004-0428-x
所属领域
代谢工程
关键词
Adenylate kinaseEnergy chargeGene replacementGeobacillus stearothermophilusThermophile
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解决的核心问题

研究腺苷酸激酶（AK）在革兰氏阳性中度嗜热菌Geobacillus stearothermophilus中维持腺嘌呤核苷酸稳态和细胞活力的作用，探究AK是否为该菌必需基因。

研究策略

通过同源重组将G. stearothermophilus NUB3621-R内源adk基因替换为嗜温菌Bacillus subtilis的adk基因，构建温度敏感型重组菌株，结合PCR、DNA测序、Southern blot、酶活测定和能量电荷（EC）测量分析AK功能。

研究路线图

100%
研究问题：
AK是否嗜热菌必需基因？
如何影响能量稳态和活力？
策略：
同源重组基因替换
嗜温菌adk替换内源adk
构建温度敏感菌株
关键改造：
染色体adk位点插入
B. subtilis adk+cat
筛选标记验证重组
结果-表型：
最高生长温度降低至56°C
（野生型75°C，差约20°C）
结果-能量电荷：
65°C重组菌EC=0.09
野生型EC=0.45（对照）
结果-温度转变：
50→65°C后EC从0.16降至0.09
回50°C无法恢复，存活仅0.001%
结果-AK活性：
野生型最适75°C，重组60°C
高温时重组AK活性骤降
结论：
AK是维持EC和细胞活力
所必需的，无可替代酶
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核心内容

该研究通过同源重组将中度嗜热菌Geobacillus stearothermophilus NUB3621-R内源adk基因替换为嗜温菌Bacillus subtilis的adk基因，构建温度敏感型重组菌株NUB3621-R:ThEV，以探究腺苷酸激酶（AK）在维持腺嘌呤核苷酸稳态和细胞活力中的作用。重组菌株最高生长温度仅为56°C，较野生型（75°C）降低约20°C。65°C下重组细胞能量电荷（EC）仅0.09，远低于野生型的0.45；温度从50°C升至65°C后，重组细胞EC由0.16降至0.09且返回50°C无法恢复，仅0.001%细胞存活，而野生型EC可恢复至0.22。酶活测定显示野生型AK最适温度为75°C，重组AK最适温度为60°C，更高温度下活性急剧下降，且两种菌株AK表达量相近（澄清裂解液比活性分别为338和369 U/mg）。结果表明AK在嗜热菌中维持高能量电荷和细胞活力中不可替代，其失活直接导致能量稳态破坏和细胞死亡，该基因替换策略为研究必需基因功能提供了温度敏感型新方法。

创新点

首次在中度嗜热芽孢杆菌中实现基因替换；利用嗜温菌同源基因替换嗜热菌必需基因产生温度敏感表型，为研究必需基因功能提供新方法。

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Geobacillus stearothermophilus NUB3621-R 腺嘌呤核苷酸代谢 adk 腺苷酸激酶 (AK) 催化 野生型内源AK，最适温度75°C
Geobacillus stearothermophilus NUB3621-R:ThEV 腺嘌呤核苷酸代谢 Bacillus subtilis adk 枯草芽孢杆菌腺苷酸激酶 催化 重组菌株中表达的AK，温度敏感，最适约60°C
Geobacillus stearothermophilus NUB3621-R:ThEV 无（筛选标记） cat 氯霉素乙酰转移酶 催化 用于筛选重组菌株的标记基因
Geobacillus stearothermophilus NUB3621-R S10-spc-alpha 基因簇 secY 前蛋白转位酶 SecY 亚基 转运 邻近adk的基因，重组后未受影响
Geobacillus stearothermophilus NUB3621-R S10-spc-alpha 基因簇 map 甲硫氨酸氨肽酶 催化 邻近adk的基因，重组后未受影响
Geobacillus stearothermophilus NUB3621-R S10-spc-alpha 基因簇 infA 翻译起始因子 IF-1 调控 邻近adk的基因，重组后未受影响

关键发现

  1. 重组菌株NUB3621-R:ThEV最高生长温度为56°C，比野生型（75°C）低约20°C
  2. 65°C下重组细胞EC为0.09，野生型为0.45
  3. 50°C时二者EC相近（重组0.23，野生型0.22）。温度转变实验中，重组细胞从50°C升至65°C后EC从0.16降至0.09，返回50°C后无法恢复，且仅0.001%细胞能存活
  4. 野生型EC从0.20升至0.43并恢复至0.22。AK活性显示野生型AK最适温度为75°C，重组AK最适温度为60°C，更高温度活性急剧下降。两种菌株AK表达量相似（澄清裂解液比活性：野生型338 U/mg，重组369 U/mg
  5. 纯化后分别为10,417和12,350 U/mg）。序列同源性：NUB3621-R adk与B. subtilis 168 adk核酸73%相同、蛋白79%相同，与G. stearothermophilus S10 adk核酸77%相同、蛋白85%相同。

研究结论

腺苷酸激酶（AK）在G. stearothermophilus中维持高腺苷酸能量电荷和细胞活力中起关键作用，没有其他酶能够替代其功能；AK失活导致能量电荷降低和细胞死亡。