Improving Ethanol Tolerance of Escherichia coli by Rewiring Its Global Regulator cAMP Receptor Protein (CRP)
- 作者
- Huiqing Chong, Lei Huang, Jianwei Yeow, Ivy Wang, Hongfang Zhang, Hao Song, Rongrong Jiang
- 单位
- School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, Singapore; Institute of Biological Engineering, Department of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou, P. R. China; System Engineering, Life Technologies, Singapore
- 杂志
- PLoS ONE（2013）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0057628
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
生物乙醇发酵中，微生物宿主对终产物乙醇的低耐受性限制了乙醇产量和发酵效率。
研究策略
通过易错PCR对全局转录因子cAMP受体蛋白（CRP）进行随机突变，在乙醇胁迫下筛选耐受性提高的突变体；将最佳突变（M59T）整合至大肠杆菌染色体构建稳定菌株iE2，并利用OpenArray高通量RT-PCR分析CRP调控基因的表达变化。
研究路线图
核心内容
针对大肠杆菌乙醇耐受性不足的问题，该研究通过易错PCR对全局转录因子cAMP受体蛋白（CRP）进行随机突变，并在乙醇胁迫下筛选出最佳突变体E2（M59T）。该突变体在62 g/L乙醇中生长速率达0.08 h⁻¹，高于对照的0.06 h⁻¹，且最终OD600（0.19）显著优于对照（0.10）。为进一步避免质粒不稳定，作者将突变整合至染色体构建稳定菌株iE2，其在150 g/L乙醇中暴露15分钟存活率约12%，而亲本株低于0.01%，暴露1小时后存活率仍高出10,000倍以上。高通量RT-PCR显示，无乙醇条件下iE2有203个CRP调控基因差异表达，乙醇胁迫下则有92个；其中srlA、srlB等PTS糖转运蛋白基因在两个菌株中均显著上调。基因敲除实验证实entA、marA和bhsA对耐受性至关重要。该工作证明改构全局调控因子CRP可系统重塑应激响应网络，为提升工业菌株乙醇耐受性提供了高效策略。
创新点
首次通过改造全局调控因子CRP实现大肠杆菌乙醇耐受性的提升；采用染色体整合避免质粒不稳定和代谢负担；结合高通量转录组揭示CRP调控网络在乙醇耐受中的全局响应。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 | 全局调控网络 | crp | cAMP receptor protein (CRP) | 调控 | 野生型CRP作为对照组；在易错PCR中作为突变模板 |
| Escherichia coli JW5702 (Δcrp) | 全局调控网络 | crp | CRP M59T | 调控 | 最佳乙醇耐受突变体E2携带M59T氨基酸替换 |
| Escherichia coli iE2 | 应激响应 | rpoS | RNA polymerase sigma factor RpoS | 调控 | 一般应激反应调控因子，乙醇胁迫下在iE2中上调 |
| Escherichia coli iE2 | 多重耐药/应激 | marA | multiple antibiotic resistance protein MarA | 调控 | 在iE2乙醇胁迫下上调，敲除marA降低乙醇耐受性 |
| Escherichia coli iE2 | TCA循环 | aceE | pyruvate dehydrogenase E1 component | 催化 | 无乙醇时在iE2中上调2倍以上 |
| Escherichia coli iE2 | TCA循环 | acnA | aconitate hydratase A | 催化 | TCA循环基因，iE2中上调 |
| Escherichia coli iE2 | TCA循环 | sdhD | succinate dehydrogenase subunit D | 催化 | TCA循环基因，iE2中上调 |
| Escherichia coli iE2 | TCA循环 | sucA | 2-oxoglutarate decarboxylase E1 component | 催化 | TCA循环基因，iE2中上调 |
| Escherichia coli iE2 | 肠杆菌素生物合成 | entA | 2,3-dihydro-2,3-dihydroxybenzoate dehydrogenase | 催化 | 在E2中上调；敲除entA降低乙醇耐受性 |
| Escherichia coli iE2 | 铁离子转运 | fecA | ferric citrate outer membrane transporter FecA | 转运 | 铁载体转运蛋白，乙醇胁迫下iE2中上调 |
| Escherichia coli iE2 | 糖转运PTS系统 | srlA | PTS glucitol/sorbitol transporter subunit IIA | 转运 | 在iE2和E2中均显著下调 |
| Escherichia coli iE2 | 应激响应 | osmY | osmotically-inducible protein Y | 区室化 | 渗透应激蛋白，iE2中上调；功能与细胞表面相关 |
| Escherichia coli iE2 | 应激响应/膜蛋白 | bhsA | outer membrane protein BhsA | 区室化 | 外膜蛋白，乙醇胁迫下上调，敲除降低乙醇耐受性 |
关键发现
- 最佳CRP突变体E2（M59T）在62 g/L乙醇中生长速率为0.08 h^-1，高于对照的0.06 h^-1，且达到更高的OD600（0.19 vs 0.10）
- 基因组整合菌株iE2在150 g/L乙醇中暴露15分钟存活率约12%，而亲本BW25113小于0.01%，暴露1小时后iE2存活率仍比BW25113高10,000倍以上。RT-PCR分析显示，无乙醇条件下iE2中203个CRP调控基因差异表达（48个上调、155个下调），乙醇胁迫下92个差异表达（71个上调、21个下调）
- 在iE2和E2中，乙醇胁迫下仅有6个上调、12个下调的共有差异基因，包括srlA、srlB等PTS糖转运蛋白基因。敲除entA、marA或bhsA后，iE2的乙醇耐受性显著下降。
研究结论
通过改造全局转录因子CRP可以显著提高大肠杆菌的乙醇耐受性，是一种高效、便捷的菌株工程策略，有助于改善生物乙醇发酵的工业菌株性能。