Biosynthesis of butyrate from methanol and carbon monoxide by recombinant Acetobacterium woodii
- 作者
- Nilanjan Pal Chowdhury, Dennis Litty, Volker Müller
- 杂志
- International Microbiology（2022）
- DOI
- 10.1007/s10123-022-00234-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
将不天然产丁酸的乙酰菌 Acetobacterium woodii 改造为能以甲醇和 CO 为原料生产丁酸的平台，扩展其产物谱到更高经济价值的化合物。
研究策略
从相关乙酰菌 Eubacterium callanderi KIST612 克隆丁酸合成途径基因（thlA, hbd, crt, bcd/etfAB 和 ptb），置于 Clostridium ljungdahlii 的 pta-ack 强启动子下，导入 A. woodii 中异源表达；并通过添加 CO 提供额外电子来增强丁酸合成。
研究路线图
核心内容
该研究将不天然产丁酸的乙酰菌Acetobacterium woodii改造为能以甲醇和一氧化碳为原料生产丁酸的平台菌株。研究人员从Eubacterium callanderi KIST612克隆了丁酸合成途径基因（thlA、hbd、crt、bcd/etfAB和ptb），置于Clostridium ljungdahlii强启动子下导入A. woodii异源表达，并通过添加CO提供额外电子增强丁酸合成。结果显示，重组菌Aw_But7在果糖上丁酸产量达1.5 mM，较Aw_But6提高400%；在60 mM甲醇上产生最高0.25 mM丁酸；静息细胞实验中添加10% CO后丁酸产量达0.35 mM。研究发现A. woodii自身具有丁酸激酶活性（0.43 U/mg），可弥补相应基因缺失。热力学分析表明，以甲醇和CO为底物产丁酸的ATP产量约为0.64至1.55 mol ATP/mol甲醇，能量效率提高约140%。该工作证明了甲醇可作为乙酰菌生物催化的替代原料，为通过敲除竞争途径将碳通量从乙酸转向丁酸提供了方向。
创新点
['首次在 A. woodii 中异源表达丁酸合成基因簇，实现从甲醇和 CO 生产丁酸', '通过共表达 ptb 基因将丁酸产量提高 400%', '发现 A. woodii 自身具有丁酸激酶活性，可弥补丁酸激酶基因缺失', '证明添加 CO 可通过提供还原型铁氧还蛋白部分克服电子不平衡，显著提高丁酸产量', '从热力学和化学计量上分析了甲醇/CO 产丁酸的 ATP 产量提升（能量效率提高约 140%）']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Acetobacterium woodii | Wood-Ljungdahl pathway / 丁酸合成途径 | thlA | 硫解酶（thiolase） | 催化 | 来源 Eubacterium callanderi KIST612（ELI_0537），克隆至 pMTL84211 载体，受 pta-ack 启动子控制 |
| Acetobacterium woodii | 丁酸合成途径 | hbd | 3-羟基丁酰-CoA 脱氢酶 | 催化 | 来源 E. callanderi KIST612（ELI_0538），参与 NADH 依赖的还原步骤 |
| Acetobacterium woodii | 丁酸合成途径 | crt | 巴豆酸酶（crotonase） | 催化 | 来源 E. callanderi KIST612（ELI_0539） |
| Acetobacterium woodii | 丁酸合成途径 | bcd/etfAB | 电子双歧丁酰-CoA 脱氢酶复合物 | 催化 | 来源 E. callanderi KIST612（ELI_0540-0542），包含 bcd 和 etfA/etfB 亚基，可还原铁氧还蛋白 |
| Acetobacterium woodii | 丁酸合成途径 | ptb | 磷酸丁酰转移酶（phosphotransbutyrylase） | 催化 | 来源 E. callanderi KIST612（ELI_0834），连同其 137 bp 上游区域克隆，共转录可提高丁酸产量 |
| Acetobacterium woodii | 丁酸合成途径 | ack (Awo_c21260) | 乙酸激酶（acetate kinase） | 催化 | A. woodii 内源酶，可能弥补缺失的丁酸激酶基因，将丁酰磷酸去磷酸化生成丁酸；细胞粗提物显示丁酸激酶活性 0.43 U/mg |
| Acetobacterium woodii | 丁酸合成途径 | Ppta-ack | 启动子元件（来自 Clostridium ljungdahlii 的磷酸转乙酰酶-乙酸激酶启动子） | 调控 | 用于驱动丁酸合成基因在 A. woodii 中异源表达 |
| Acetobacterium woodii | 甲醇代谢 | mtm/mtt（推断） | 甲醇特异性甲基转移酶系统 | 催化 | 内源系统，催化甲醇与四氢叶酸结合生成甲基-THF，是甲醇利用的第一步 |
| Acetobacterium woodii | 能量代谢 | rnf | Rnf 复合体 | 能量供给 | 膜结合转氢酶，通过反向电子传递将 NADH 氧化产生的电子用于还原铁氧还蛋白，并建立离子梯度驱动 ATP 合成 |
| Acetobacterium woodii | Wood-Ljungdahl pathway | CODH/ACS | 一氧化碳脱氢酶/乙酰-CoA 合酶 | 催化 | 催化 CO2/CO 与甲基-THF 缩合生成乙酰-CoA，是自养生长的核心酶 |
关键发现
- ['重组菌 Aw_But7 在 20 mM 果糖上生长时丁酸产量达到
- 5 mM，比 Aw_But6 提高 400%', 'Aw_But6 和 Aw_But7 在果糖上的倍增时间分别为
- 8 h 和 9 h', '在 60 mM 甲醇上生长时，Aw_But7 产生约 38 mM 乙酸，丁酸最高
- 25 mM；野生型甲醇倍增时间为 16 h，重组菌为 24 h', '静息细胞实验中，Aw_But7 从果糖产生
- 2 mM 丁酸，是 Aw_But6（0.3 mM）的 4 倍（提高 400%）', '甲醇生长的静息细胞中添加 10% CO 后，丁酸产量达到
- 35 mM', '碳回收率为 78-83%（未计入 CO2）', '细胞粗提物中丁酸激酶活性：A. woodii 为
- 43 U/mg，E. callanderi 为
- 57 U/mg；乙酸激酶活性分别为
- 1 U/mg 和
- 38 U/mg', '理论上，5 mol 甲醇 + 1 mol CO2 产
- 5 mol 丁酸，ATP 产量为
- 64 mol ATP/mol 甲醇；2 mol 甲醇 + 5 mol CO 产 1 mol 丁酸，ATP 产量为
- 55 mol ATP/mol 甲醇（能量效率提高约 140%）']
研究结论
通过异源表达丁酸合成途径，A. woodii 能够从甲醇或甲醇+CO 生产丁酸，证明甲醇可作为乙酰菌生物催化的替代原料，并为未来通过基因缺失（如敲除 pta/ack）将碳通量从乙酸转向丁酸提供了方向。