高级醇 · 代谢工程文献库

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Characterization of VvPAL-like promoter from grapevine using transgenic tobacco plants

作者
SongTao Jiu, Chen Wang, Ting Zheng, Zhongjie Liu, XiangPeng Leng, Tariq Pervaiz, Abolfazl Lotfi, JingGui Fang, XiaoMin Wang
单位
南京农业大学园艺学院，遗传与果实发育重点实验室，江苏省南京市，中华人民共和国；伊朗德黑兰国家遗传工程与生物技术研究所（NIGEB）农业生物技术系植物分子生物技术室；中国科学院江苏省植物研究所，江苏省南京市，中华人民共和国
杂志
Functional & Integrative Genomics（2017）
DOI
10.1007/s10142-016-0516-x
所属领域
代谢工程
关键词
启动子时空表达苯丙氨酸解氨酶类似蛋白转基因烟草非生物胁迫
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解决的核心问题

解析葡萄VvPAL-like基因启动子的时空表达特性及其对非生物胁迫的响应调控机制

研究策略

从‘夏黑’葡萄中克隆VvPAL-like基因2000 bp启动子，构建启动子-GUS融合载体并转化烟草，通过5'系列缺失、组织化学染色、GUS荧光定量及多种逆境处理分析启动子功能区域

研究路线图

100%
研究问题：解析葡萄VvPAL-like启动子时空表达及胁迫响应机制
策略：克隆2000bp启动子，构建启动子-GUS载体转化烟草
关键改造(1)：5'端系列缺失（P1461/P930/P424/P292）
关键改造(2)：组织化学染色+GUS荧光定量检测
关键改造(3)：乙烯、MeJA、ABA、IAA、Cu及干旱等逆境处理
结果(1)：表达特征——果实成熟期升高，茎中最强，花粉粒58.33%显蓝
结果(2)：功能区域——负调控区(-424/-292)、乙烯响应区(-1461/-930)、MeJA响应区(-424/-292)
结果(3)：顺式元件——TATA-box(TSS上游28bp)、CAAT-box、ERE(-1173/-1166)、CGTCA-motif(-315/-311)
结论：启动子含多个组织特异及胁迫响应元件，不同区域分别调控时空表达与乙烯/MeJA应答，为类黄酮生物合成和逆境响应提供分子基础
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核心内容

该研究从“夏黑”葡萄中克隆了VvPAL-like基因2000 bp的启动子，并构建启动子-GUS融合载体转化烟草，通过5'系列缺失、组织化学染色、GUS荧光定量及多种胁迫处理解析其功能。结果显示，VvPAL-like与已报道的葡萄PAL序列一致性高达98%以上，启动子预测的转录起始位点位于ATG上游138 bp。在转基因烟草中，启动子驱动GUS在子叶、下胚轴、花粉、毛状体及维管束中表达，其中58.33%的花粉粒呈蓝色。5'缺失分析鉴定出负调控区域（-424至-292）、乙烯响应区域（-1461至-930）及MeJA响应区域（-424至-292），且启动子受光、铜、ABA、IAA、MeJA、乙烯和干旱诱导。qRT-PCR显示该基因在果实成熟期表达逐渐升高，茎中表达最高。该研究系统揭示了VvPAL-like启动子包含多个组织特异性和胁迫响应顺式元件，其不同功能区域分别调控时空表达及逆境应答，为理解该基因参与类黄酮生物合成和胁迫响应提供了分子基础。

创新点

首次对葡萄VvPAL-like启动子进行系统研究；鉴定出负调控区域(-424至-292)、乙烯响应区域(-1461至-930)和MeJA响应区域(-424至-292)；发现启动子在维管束、花粉、毛状体等组织特异表达

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Vitis vinifera 'Summer Black' (夏黑葡萄) 苯丙烷/类黄酮生物合成 VvPAL-like (GSVTVG00013928001) PAL-like蛋白 催化 克隆来源，与EF192469.1 PAL高度同源（核苷酸一致性98.17%，蛋白一致性98.59%）
Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi (转基因烟草) 报告基因检测体系 GUS (uidA) β-葡萄糖醛酸酶 (GUS) 催化 作为报告基因评估启动子活性
Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi (转基因烟草) 苯丙烷代谢调控 VvPAL-like启动子 (pVvPAL-like) — 调控 2000 bp全长及P1461、P930、P424、P292缺失片段驱动GUS表达

关键发现

  1. VvPAL-like与已报道的葡萄PAL（EF192469.1）核苷酸序列一致性98.17% (2094/2133)，蛋白序列一致性98.59% (700/710)
  2. 克隆的启动子长2000 bp，预测转录起始位点(TSS)位于ATG上游138 bp，TATA-box位于TSS上游28 bp，CAAT-box位于TATA上游273 bp
  3. qRT-PCR显示VvPAL-like在果实成熟过程中表达逐渐升高，FR和HR期最高，组织表达以茎最高、根和叶中等、卷须最低
  4. 转基因烟草中启动子驱动GUS在子叶、下胚轴、柱头、花药、花粉、子房、毛状体和维管束中表达，58.33%的花粉粒呈蓝色
  5. 5'缺失分析发现在-424至-292区域存在负调控元件
  6. 乙烯响应元件位于-1461/-930区域（ERE在-1173至-1166），MeJA响应元件位于-424/-292区域（CGTCA-motif在-315至-311）
  7. 启动子受光、Cu、ABA、IAA、MeJA、乙烯和干旱诱导

研究结论

VvPAL-like启动子具有复杂的转录调控机制，包含多个组织特异性和胁迫响应顺式作用元件，其不同功能区域分别调控时空表达及乙烯/MeJA等胁迫应答，为进一步理解VvPAL-like参与类黄酮生物合成和逆境响应提供了分子基础