Effect of carbon sources differing in oxidation state and transport route on succinate production in metabolically engineered Escherichia coli
- 作者
- Henry Lin, George N. Bennett, Ka-Yiu San
- DOI
- 10.1007/s10295-005-0206-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过碳源选择（氧化态和转运方式）及途径失活来满足琥珀酸合成对NADH和PEP的需求，提高琥珀酸产量
研究策略
选用山梨醇（氧化态-1，产生更多NADH）和木糖（非PTS转运，保留PEP）作为碳源，与葡萄糖比较；过表达高粱突变型PEPC；构建乙酸（ΔackA-pta）和乳酸（ΔldhA）途径失活菌株，分析代谢物分布
核心内容
本研究系统考察了碳源氧化态与转运方式对工程大肠杆菌产琥珀酸的影响。选用高还原态的山梨醇（氧化态-1）和经非PTS系统转运的木糖，与葡萄糖作对比，并过表达抗反馈抑制的高粱突变型PEPC（S8D）以强化从PEP到草酰乙酸的羧化支路。结果显示，山梨醇因提供额外NADH使琥珀酸产量达64.11 mM，较葡萄糖提高96%，摩尔产率提高81%（0.312 vs 0.172）；木糖因保留PEP使产量提高51%。进一步失活乙酸途径（ΔackA-pta）后，碳流意外大量转向乳酸，产量增加15倍；而同时失活乙酸和乳酸途径（ΔackA-pta, ΔldhA）后，山梨醇下琥珀酸摩尔产率达0.661，木糖下达0.433，乙醇产率也显著提升。该工作证实NADH与PEP是琥珀酸合成的关键限制因子，揭示了代谢网络扰动下碳流重分配的复杂性，为通过碳源选择与途径失活组合策略优化还原性产物合成提供了依据。
创新点
系统揭示了碳源氧化态和转运方式对琥珀酸生产的影响；利用S8D突变高粱PEPC消除苹果酸反馈抑制；发现乙酸途径失活后碳流主要流向乳酸而非琥珀酸，双途径失活后乙醇产量显著增加
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli GJT001（含质粒pKK313） | 琥珀酸合成 | pepc (Sorghum, S8D mutant) | 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC） | 催化 | 过表达苹果酸反馈抑制不敏感的高粱PEPC突变体，促进琥珀酸合成 |
| Escherichia coli YBS121（ΔackA-pta） | 乙酸合成 | ackA-pta | — | 催化 | 乙酸途径失活，导致乳酸产量显著增加 |
| Escherichia coli YBS132（ΔackA-pta, ΔldhA） | 乳酸合成 | ldhA | 乳酸脱氢酶（LDH） | 催化 | 乳酸途径失活，与乙酸失活共同作用提高琥珀酸和乙醇产量 |
| Escherichia coli | 葡萄糖转运（PTS系统） | ptsG | 葡萄糖磷酸转移酶系统 | 转运 | 葡萄糖经PTS转运消耗1 mol PEP，降低琥珀酸前体供给 |
| Escherichia coli | 木糖转运 | — | 木糖高亲和力透性酶 | 转运 | 木糖转运依赖ATP而非PTS，可保存PEP用于琥珀酸合成 |
关键发现
- 在含pKK313的GJT菌株中（实验A），与葡萄糖相比，山梨醇使琥珀酸产量提高96%（64.11 mM vs
- 74 mM），摩尔产率提高81%（0.312 vs
- 172），乙醇产量提高75%；木糖使琥珀酸产量提高51%（49.54 mM），摩尔产率提高17%（0.201 vs
- 172）。乙酸途径失活（YBS121）导致葡萄糖发酵乳酸产量和产率增加15倍；同时失活乙酸和乳酸途径（YBS132）后，山梨醇下琥珀酸摩尔产率达0.661，木糖下达0.433，乙醇摩尔产率分别达0.657和0.282。
研究结论
研究表明NADH和PEP是琥珀酸合成的关键限制因素。山梨醇通过提供额外NADH，木糖通过保存PEP，均能有效提高琥珀酸产量。仅失活乙酸途径会使碳流大量转向乳酸，同时失活乙酸和乳酸途径后，琥珀酸和乙醇产量均提高，体现了代谢网络应对扰动的复杂动态特性。