Cloning and Characterization of Genes Involved in Nostoxanthin Biosynthesis of Sphingomonas elodea ATCC 31461
- 作者
- Liang Zhu, Xuechang Wu, Ou Li, Chaodong Qian, Haichun Gao
- 单位
- Institute of Microbiology, College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang, People's Republic of China
- 杂志
- PLoS ONE（2012）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0035099
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
阐明Sphingomonas elodea ATCC 31461中诺斯蒽黄素（nostoxanthin）生物合成相关基因及其功能，解析其生物合成途径。
研究策略
通过SiteFinding-PCR和CODEHOP策略克隆类胡萝卜素生物合成基因簇及相关基因，利用基因敲除和异源表达结合HPLC和LC-MS分析鉴定各基因的功能，最终提出完整的生物合成途径。
研究路线图
核心内容
该研究从Sphingomonas elodea ATCC 31461中克隆并鉴定了参与诺斯蒽黄素生物合成的基因簇及簇外基因crtZ。通过SiteFinding-PCR和CODEHOP策略获得全长8412 bp的基因簇，包含crtG、crtY、crtI和crtB四个基因，分别编码2,2'-β-羟化酶、番茄红素环化酶、八氢番茄红素脱氢酶和八氢番茄红素合成酶；簇外crtZ编码3,3'-β-羟化酶。基因敲除实验表明，ΔcrtZ累积2,2'-二羟基-β-胡萝卜素和β-胡萝卜素，ΔcrtG主要累积玉米黄质，ΔcrtZG仅累积β-胡萝卜素，ΔcrtY累积番茄红素，ΔcrtB不产生任何类胡萝卜素。异源表达证实CrtG可直接作用于β-胡萝卜素生成2,2'-二羟基-β-胡萝卜素，并可与CrtZ协同催化玉米黄质生成诺斯蒽黄素。据此提出完整合成途径：GGPP经CrtB、CrtI、CrtY依次合成β-胡萝卜素，再由CrtZ和CrtG催化羟基化生成诺斯蒽黄素。该研究为通过基因敲除获得无色突变株以降低结冷胶生产成本提供了依据，也为异源合成稀有羟基化类胡萝卜素提供了基因资源。
创新点
首次从Sphingomonas elodea ATCC 31461中克隆和鉴定了nostoxanthin生物合成基因簇（crtG、crtY、crtI、crtB）及位于簇外的crtZ基因；证实CrtG能够直接作用于β-胡萝卜素生成2,2'-二羟基-β-胡萝卜素，并可与CrtZ协同催化生成nostoxanthin。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sphingomonas elodea ATCC 31461 | 类胡萝卜素生物合成 | crtG | CrtG（2,2'-β-羟化酶） | 催化 | 催化β-胡萝卜素或玉米黄质的2,2'-位羟基化，异源表达可将β-胡萝卜素转化为2,2'-二羟基-β-胡萝卜素，将玉米黄质转化为nostoxanthin |
| Sphingomonas elodea ATCC 31461 | 类胡萝卜素生物合成 | crtY | CrtY（番茄红素环化酶） | 催化 | 催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素，敲除后累积番茄红素 |
| Sphingomonas elodea ATCC 31461 | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | CrtI（八氢番茄红素脱氢酶） | 催化 | 催化八氢番茄红素经过四步脱氢生成番茄红素，此前已克隆并敲除 |
| Sphingomonas elodea ATCC 31461 | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | CrtB（八氢番茄红素合成酶） | 催化 | 催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素，敲除后无类胡萝卜素累积 |
| Sphingomonas elodea ATCC 31461 | 类胡萝卜素生物合成 | crtZ | CrtZ（3,3'-β-羟化酶） | 催化 | 催化β-胡萝卜素3,3'-位羟基化生成玉米黄质，敲除后不产生3-羟基类胡萝卜素；位于基因簇外 |
关键发现
- 克隆的类胡萝卜素生物合成基因簇长8412 bp，包含crtG（798 bp，编码2,2'-β-羟化酶，与Brevundimonas aurantiaca CrtG同源性44%）、crtY（1158 bp，编码番茄红素环化酶，与Pantoea sp. CrtY同源性44%）、crtI（1479 bp，编码八氢番茄红素脱氢酶，与Erythrobacter longus CrtI同源性68%）、crtB（924 bp，编码八氢番茄红素合成酶，与Pantoea agglomerans CrtB同源性53%）
- crtZ基因长501 bp，编码3,3'-β-羟化酶，与Pantoea ananatis CrtZ同源性54%。基因敲除突变体分析：ΔcrtZ不产生3-羟基类胡萝卜素，累积2,2'-二羟基-β-胡萝卜素和β-胡萝卜素
- ΔcrtG缺失nostoxanthin和caloxanthin，主要累积玉米黄质
- ΔcrtZG仅累积β-胡萝卜素
- ΔcrtY累积番茄红素
- ΔcrtB不产生任何类胡萝卜素。异源互补实验：在E. coli中表达crtZ可将β-胡萝卜素转化为玉米黄质
- 共表达crtG可使β-胡萝卜素转化为2,2'-二羟基-β-胡萝卜素，使玉米黄质转化为nostoxanthin。
研究结论
提出了Sphingomonas elodea ATCC 31461中nostoxanthin的生物合成途径：GGPP经CrtB合成八氢番茄红素，CrtI脱氢生成番茄红素，CrtY环化生成β-胡萝卜素，再由CrtZ和CrtG催化羟基化生成nostoxanthin。该研究有助于通过基因敲除获得无色突变株以降低结冷胶生产成本，并为利用crtG异源合成稀有羟基化类胡萝卜素提供了基因资源。